只要堅持、努力，勝利就會屬于你！“雜交瘤技術(shù)”是檢驗職稱考試需要掌握的知識，那“雜交瘤技術(shù)”的原理是什么？具體步驟又有哪些？以下是醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)小編為大家整理的相關(guān)知識，希望有助于大家備考！祝大家考試順利，取得好成績！

雜交瘤技術(shù)的基本原理是通過融合兩種細(xì)胞而同時保持兩者的主要特征。

這兩種細(xì)胞分別是經(jīng)抗原免疫的小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞。被特異性抗原免疫的小鼠脾細(xì)胞（B淋巴細(xì)胞）的主要特征是它的抗體分泌功能，但不能在體外連續(xù)培養(yǎng)，小鼠骨髓瘤細(xì)胞則可在培養(yǎng)條件下無限分裂、增殖，即具有所謂永生性。

在選擇培養(yǎng)基的作用下，只有B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合的雜交細(xì)胞才能具有持續(xù)培養(yǎng)的能力，形成同時具備抗體分泌功能和保持細(xì)胞永生性兩種特征的細(xì)胞克隆。

其原理從下列3個主要步驟闡明。

(一)細(xì)胞的選擇與融合

建立雜交瘤技術(shù)的目的是制備對抗原特異的單克隆抗體，所以融合細(xì)胞一方必須選擇經(jīng)過抗原免疫的B細(xì)胞，通常來源于免疫動物的脾細(xì)胞。

脾是B細(xì)胞聚集的重要場所，無論以何種免疫方式刺激，脾內(nèi)皆會出現(xiàn)明顯的抗體應(yīng)答反應(yīng)。融合細(xì)胞的另一方則是為了保持細(xì)胞融合后細(xì)胞的不斷增殖，只有腫瘤細(xì)胞才具備這種特性。

選擇同一體系的細(xì)胞可增加融合的成功率。多發(fā)性骨髓瘤是B細(xì)胞系惡性腫瘤，所以是理想的脾細(xì)胞融合伴侶。

使用細(xì)胞融合劑造成細(xì)胞膜一定程度的損傷，使細(xì)胞易于相互粘連而融合在一起。

最佳的融合效果應(yīng)是最低程度的細(xì)胞損傷而又產(chǎn)生最高頻率的融合。聚乙二醇(PEG1 000～2 000)是最常用的細(xì)胞融合劑，一般應(yīng)用濃度為40%(W/V)。

(二)選擇培養(yǎng)基的應(yīng)用

細(xì)胞融合是一個隨機(jī)的物理學(xué)過程。在小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞混合細(xì)胞懸液中，經(jīng)融合后細(xì)胞將以多種形式出現(xiàn)。

如融合的脾細(xì)胞和瘤細(xì)胞、融合的脾細(xì)胞和脾細(xì)胞、融合的瘤細(xì)胞和瘤細(xì)胞、未融合的脾細(xì)胞、未融合的瘤細(xì)胞以及細(xì)胞的多聚體形式等。

正常的脾細(xì)胞在培養(yǎng)基中僅存活5～7d，無需特別篩選，細(xì)胞的多聚體形式也容易死去，而未融合的瘤細(xì)胞則需進(jìn)行特別的篩選去除。

細(xì)胞DNA合成一般有兩條途徑。主要途徑是由糖和氨基酸合成核苷酸，進(jìn)而合成DNA，葉酸作為重要的輔酶參與這一合成過程。

另一輔助途徑是在次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情況下，經(jīng)次黃嘌吟磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化作用合成DNA。

細(xì)胞融合的選擇培養(yǎng)基中有3種關(guān)鍵成分：次黃嘌呤(hypoxanthine，H)、甲氨蝶呤(aminopterin，A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine，T)，所以取三者的字頭稱為HAT培養(yǎng)基。

甲氨蝶呤是葉酸的拮抗劑，可阻斷瘤細(xì)胞利用正常途徑合成DNA，而融合所用的瘤細(xì)胞是經(jīng)毒性培養(yǎng)基選出的HGPRT-細(xì)胞株，所以不能在該培養(yǎng)基中生長。只有融合細(xì)胞具有親代雙方的遺傳性能，可在HAT培養(yǎng)基中長期存活與繁殖。

(三)有限稀釋與抗原特異性選擇

在動物免疫中，應(yīng)選用高純度抗原。

一種抗原往往有多個決定簇，一個動物體在受到抗原刺激后產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答實質(zhì)是眾多B細(xì)胞群的抗體分泌，而針對目標(biāo)抗原表位的B細(xì)胞只占極少部分。

由于細(xì)胞融合是一個隨機(jī)的過程，在已經(jīng)融合的細(xì)胞中有相當(dāng)比例的無關(guān)細(xì)胞的融合體，需經(jīng)篩選去除。

篩選過程一般分為兩步進(jìn)行：一是融合細(xì)胞的抗體篩選，二是在此基礎(chǔ)上進(jìn)行的特異性抗體篩選。

將融合的細(xì)胞進(jìn)行充分稀釋，使分配到培養(yǎng)板的每一孔中的細(xì)胞數(shù)在0至數(shù)個細(xì)胞之間(30%的孔為0才能保證每個孔中是單個細(xì)胞)，培養(yǎng)后取上清液用ELISA法選出抗體高分泌性的細(xì)胞；這一過程常被習(xí)慣地稱作克隆化。將這些陽性細(xì)胞再進(jìn)行克隆化，應(yīng)用特異性抗原包被的ELISA找出針對目標(biāo)抗原的抗體陽性細(xì)胞株，增殖后進(jìn)行凍存、體外培養(yǎng)或動物腹腔接種培養(yǎng)。

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