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    細胞凋亡的檢測方法

    2017-06-22 17:16 來源:
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    細胞凋亡的幾種檢測方法是免疫檢驗必不可少的一項,檢驗人員都應(yīng)該了解的,醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)整理了相關(guān)內(nèi)容,希望能夠幫到大家。

    一、形態(tài)學(xué)觀察方法

    1、HE染色、光鏡觀察:凋亡細胞呈圓形,胞核深染,胞質(zhì)濃縮,染色質(zhì)成團塊狀,細胞表面有“出芽”現(xiàn)象。

    2、丫啶橙(AO)染色,熒光顯微鏡觀察:醫(yī)學(xué)教/育網(wǎng)搜集整理活細胞核呈黃綠色熒光,胞質(zhì)呈紅色熒光。凋亡細胞核染色質(zhì)呈黃綠色濃聚在核膜內(nèi)側(cè),可見細胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。

    3、臺盼藍染色:如果細胞膜不完整、破裂,臺盼藍染料進入細胞,細胞變藍,即為壞死。如果細胞膜完整,細胞不為臺盼藍染色,則為正常細胞或凋亡細胞。此方法對反映細胞膜的完整性,區(qū)別壞死細胞有一定的幫助。

    4、透射電鏡觀察:可見凋亡細胞表面微絨毛消失,核染色質(zhì)固縮、邊集,常呈新月形,核膜皺褶,胞質(zhì)緊實,細胞器集中,胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細胞吞噬現(xiàn)象。

    二、DNA凝膠電泳

    (一)檢測原理

    細胞發(fā)生凋亡或壞死,其細胞DNA均發(fā)生斷裂,細胞內(nèi)小分子量DNA片斷增加,高分子DNA減少,胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)DNA片斷。但凋亡細胞DNA斷裂點均有規(guī)律的發(fā)生在核小體之間,出現(xiàn)180-200bpDNA片斷,而壞死細胞的DNA斷裂點為無特征的雜亂片斷,利用此特征可以確定群體細胞的死亡,并可與壞死細胞區(qū)別。

    (二)結(jié)果判斷

    正常活細胞DNA 電泳出現(xiàn)階梯狀(LADDER)條帶;壞死細胞DNA電泳類似血抹片時的連續(xù)性條帶。

    三、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)核小體測定

    凋亡細胞的DNA斷裂使細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)核小體。核小體由組蛋白及其伴隨的DNA片斷組成,可由ELISA法檢測。

    (一)檢測步驟

    1、將凋亡細胞裂解后高速離心,其上清液中含有核小體;

    2、在微定量板上吸附組蛋白體;

    3、加上清夜使抗組蛋白抗體與核小體上的組蛋白結(jié)合;

    4、加辣過氧化物酶標記的抗DNA抗體使之與核小體上的DNA結(jié)合;

    4、加酶的底物,測光吸收制。

    (二)用途

    該法敏感性高,可檢測5*100/ml凋亡細胞??捎糜谌?、大鼠、小鼠的凋亡檢測。該法不需要特殊儀器,適合基層工作,但是不能精確測定凋亡細胞發(fā)生的絕多對量。

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