?。?）融合：細(xì)胞雜交之前，要分別準(zhǔn)備好脾臟的B細(xì)胞懸液和小鼠骨髓瘤細(xì)胞（如SP2/0—Agl4細(xì)胞株）。免疫后的小鼠脾臟在無菌條件下破碎，將B細(xì)胞懸浮在沒有血清的培養(yǎng)液中（通常使用RPMIl640商品配制），醫(yī).學(xué)教育網(wǎng)搜集整理并洗滌3次去掉小鼠的血清。SP2/0細(xì)胞是用加有10%胎牛或小牛血清培養(yǎng)的，每天更換新鮮培養(yǎng)液使成為對(duì)數(shù)分裂期生長旺盛的細(xì)胞。細(xì)胞用RPMIl640洗滌2—3次，把兩種細(xì)胞合并在同—試管中，用50%的聚乙二醇（相對(duì)分子質(zhì)量為1000—1500）作為融合劑，在37℃條件下融合l—2min.然后用1640培養(yǎng)液緩慢稀釋，然后除去PEG，將細(xì)胞分散至HAT選擇培養(yǎng)板中。電融合方法也可用于單克隆抗體制備，雖融合率較高，但一次融合的細(xì)胞數(shù)少，且需專門設(shè)備，故限制了其廣泛使用。融合時(shí)脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的比例在5：1—10：1均可獲得滿意結(jié)果，每次融合細(xì)胞數(shù)量在10—10較為合適。融合后的細(xì)胞在40或96孔板上的HAT培養(yǎng)液（RPMIl640含10%—20%胎牛或小牛血清和HAT）中37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。融合后的細(xì)胞懸液中只有脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞形成的雜交瘤細(xì)胞能在HAT培養(yǎng)基中生長，其他形式的融合細(xì)胞均不能生長。未融合的細(xì)胞也不能在HAT培養(yǎng)液中生存。

　　在融合后的細(xì)胞培養(yǎng)過程中，飼養(yǎng)細(xì)胞（feeder cell）有助于雜交瘤細(xì)胞的生長。飼養(yǎng)細(xì)胞可用同種動(dòng)物的腹腔細(xì)胞或胸腹細(xì)胞。腹腔細(xì)胞中的吞噬細(xì)胞能清除死亡細(xì)胞碎片。使背景更為清潔“干凈”。醫(yī).學(xué)教育網(wǎng)搜集整理同時(shí)飼養(yǎng)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子或活性物質(zhì)有助于雜交瘤細(xì)胞的生長?，F(xiàn)有商品“雜交瘤細(xì)胞生長因子”可用于替代飼養(yǎng)細(xì)胞。

　?。?）陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選與單克降化：雜交細(xì)胞經(jīng)約10—14d培養(yǎng)后，形成可用的細(xì)胞集落（克?。?。經(jīng)過幾次更換培養(yǎng)液（HT培養(yǎng)液）后進(jìn)行抗體活性檢測。常用的篩選槍測方法是ELISA和凝集試驗(yàn)，前者常用于可溶性抗原，后者適用于細(xì)胞、細(xì)菌等表面抗原。此外，Dot－ELISA、免疫印跡及免疫熒光試驗(yàn)均可用于雜交瘤細(xì)胞的篩選。

　　使許多細(xì)胞克隆混合生長的細(xì)胞分離為單個(gè)的細(xì)胞克隆的過程稱克隆化（colonization）最常用的單克隆化方法是有限稀釋法（limiteddilution），即將混合細(xì)胞經(jīng)稀釋后分裝于培養(yǎng)板上，使培養(yǎng)板的大部分孔中只出現(xiàn)一個(gè)細(xì)胞。為了確?？贵w分泌細(xì)胞來源于單個(gè)細(xì)胞，克隆化過程可重復(fù)進(jìn)行，稱為亞克隆化（subclonization）。除有限稀釋法外，熒光激活細(xì)胞分揀法（FACS）也用于雜交瘤細(xì)胞的克隆化過程。