血液涂片的制作與染色是臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技士考試需要了解的知識(shí)點(diǎn)，醫(yī)學(xué)教育|網(wǎng)搜集整理了相關(guān)內(nèi)容，希望對(duì)廣大復(fù)習(xí)備考的考生有所幫助。

血液涂片的制作與染色：

做好血液涂片和正確染色是血液細(xì)胞檢驗(yàn)的重要步驟，涂片和染色效果的好壞直接關(guān)系著檢驗(yàn)的結(jié)果，必須以認(rèn)真負(fù)責(zé)的態(tài)度注意操作過(guò)程的每一個(gè)環(huán)節(jié)。

一．玻片的清潔

1．一般清洗法

（1）將玻片放入肥皂或洗衣粉水中煮沸20分鐘。

（2）用熱水將肥皂和血膜等污物洗去，再用自來(lái)水反復(fù)沖洗，最后再用蒸餾水沖洗3～5次。必要時(shí)再置95%乙醇中浸泡1小時(shí)，然后擦干或烘干備用。新玻片常有游離堿質(zhì)，因此應(yīng)用清潔液或10%鹽酸浸泡24小時(shí)，然后分別用自來(lái)水及蒸餾水徹底洗滌。

2．油污載片清洗法

（1）清洗液

甲液：10g/L的過(guò)錳酸鉀水溶液，乙液：25g/L的草酸水溶液。

（2）清洗方法：將用過(guò)的玻片投入甲液數(shù)小時(shí)，取出后再投入乙液數(shù)小時(shí)，然后用自來(lái)水和蒸餾水沖洗干凈后再置95%乙醇中，以毛巾擦干凈即成。久用后甲液可出現(xiàn)泥沙樣沉淀，乙液有乳白色沉淀，可用棉花濾去再用，如乙液褪色應(yīng)重新配置。

二．血涂片制作

取末梢血1滴，置載玻片一端，取另一邊緣光滑的推片，放在血滴前面慢慢后移，接觸血滴后稍停。血液即沿推片散開，將推片與載片保持30～45°角，向前平穩(wěn)均勻推動(dòng)推片，載片上便留下一層薄血膜。血涂片制成后，立即在空氣中揮動(dòng)，使其迅速干燥，以免血細(xì)胞變形。血膜干燥后，用鉛筆在血膜的一側(cè)寫上病人姓名或編號(hào)。

一張良好的血片，厚薄要適宜，頭體尾要明顯，細(xì)胞分布要均勻，膜的邊緣要整齊，并留有一定的空隙。

涂片時(shí)，血滴愈大，角度愈大，推片速度愈快則血膜愈厚，反之血膜愈薄。太薄的血膜片50%的白細(xì)胞集中于邊緣或尾部，不利于白細(xì)胞分類。如果血膜分布不勻，主要是推片不整齊，用力不均勻，載片不清潔所致。

三．染色

1．瑞氏染色法（Wrightstaining）

本法的特點(diǎn)是將固定和染色合并在一起進(jìn)行，手續(xù)簡(jiǎn)便，染色時(shí)間短，對(duì)白細(xì)胞中的特異性顆粒著色較好，但對(duì)核的著色較差。

（1）原理：瑞氏染粉是由伊紅和美藍(lán)混合后組成的一種中性鹽染料。伊紅是一種酸性染料，為伊紅鈉鹽，其有色部分為陰離子；美藍(lán)是一種堿性染料，為氯化美藍(lán)，有色基團(tuán)為陽(yáng)離子。如以M+代表美藍(lán)，以E-代表伊紅，其反應(yīng)式為：

M+Cl-+Na+E→ME↓+NaCl

美藍(lán)；伊紅；伊紅化美藍(lán)（瑞士染料）

將適量的ME溶解在甲醇中，即成為瑞氏染液。甲醇的作用可使ME溶解，解離為M+和E－，這兩種有色離子可以選擇性地吸附血細(xì)胞內(nèi)的不同成分而著色。甲醇的另一個(gè)作用是有很強(qiáng)的脫水作用，可將細(xì)胞固定為一定形態(tài)，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凝固時(shí)，蛋白質(zhì)被沉淀為顆粒狀或者網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞結(jié)構(gòu)的表面積，提高對(duì)染料的吸附作用，增強(qiáng)染色效果。

細(xì)胞的著色過(guò)程是染料透入被染物并存留其內(nèi)部的一種過(guò)程，此過(guò)程既有物理吸附作用，又有化學(xué)親和作用。各種細(xì)胞及細(xì)胞的各種成分由于其化學(xué)性質(zhì)不同，對(duì)各種染料的親和力也不一樣，因此，在血片上可以見到不同的著色。細(xì)胞中堿性物質(zhì)與酸性染料伊紅結(jié)合染成紅色，因此該物質(zhì)又稱為嗜酸性物質(zhì)。如，紅細(xì)胞中的血紅蛋白，嗜酸性粒細(xì)胞胞漿中的顆粒為堿性物質(zhì)，這些物質(zhì)可與伊紅結(jié)合染成紅色。細(xì)胞中的酸性物質(zhì)可與染液中的堿性染料美藍(lán)結(jié)合染成藍(lán)色，該物質(zhì)又稱嗜堿性物質(zhì)，如：嗜堿性粒細(xì)胞中的顆粒為酸性物質(zhì)可與堿性染料美藍(lán)結(jié)合染成藍(lán)色。細(xì)胞核主要由脫氧核糖核酸和強(qiáng)堿性的組蛋白、精蛋白等形式的核蛋白所組成，這種強(qiáng)堿性的物質(zhì)與瑞氏染液中的酸性染料伊紅結(jié)合成紅色，但因?yàn)楹说鞍字羞€有少量的弱酸性物質(zhì)，它們又與染料中的堿性染料美藍(lán)作用染成藍(lán)色。但因含量太少，藍(lán)色反應(yīng)極弱，故核染色呈現(xiàn)紫紅色。幼稚紅細(xì)胞的胞漿和細(xì)胞核的核仁中含有酸性物質(zhì)，它們與染液中的堿性染料美藍(lán)有親和力，故染成藍(lán)色。當(dāng)細(xì)胞含酸、堿性物質(zhì)各半時(shí)，它們既與酸性染料作用，又與堿性染料作用，染成紅藍(lán)色或灰紅色，即所謂多嗜性。當(dāng)胞漿中的酸性物質(zhì)消失時(shí)，只與染液中的伊紅起作用，則染成紅色，即所謂正色性。

（2）試劑

①瑞氏染液

瑞氏染料（粉）1．0g

純甲醇（AR級(jí)以上）600．0ml

將全部染料放入乳缽內(nèi)，先加少量甲醇慢慢地研磨（至少半小時(shí)），以使染料充分溶解，再加一些甲醇混勻，然后將溶解的部分倒人潔凈的棕色瓶?jī)?nèi)，乳缽內(nèi)剩余的未溶解的染料，再加入少許甲醇細(xì)研，如此多次研磨，直至染料全部溶解，甲醇用完為止。密閉保存。

②磷酸鹽緩沖液（pH6．4～6．8）

磷酸二氫鉀（KH2PO4）0．3g

磷酸氫二鈉（Na2HPO4）0．2g

蒸餾水加至1000．0ml

配好后用磷酸鹽溶液校正pH，如無(wú)緩沖液可用新鮮蒸餾水代替。

（3）操作

①用蠟筆在血膜兩頭劃線，以防染液溢出，然后將血膜平放在染色架上。

②用瑞氏染液3～5滴覆蓋整個(gè)血膜，固定細(xì)胞0．5～1分鐘。

③滴加等量或稍多的緩沖液，用吸球?qū)⑵渑c染液吹勻，或者搖動(dòng)玻片染色5～10分鐘。

④慢慢搖動(dòng)玻片，然后用流動(dòng)水從玻片的一側(cè)沖去染液，待血片自然干燥后（或用濾紙吸干），即可鏡檢。

2．姬姆薩染色法（Giemsastaining）

（1）原理姬姆薩染料由天青、伊紅組成，其染色原理與瑞氏染色法基本相同，但姬姆薩染色

法對(duì)細(xì)胞核著色較好，結(jié)構(gòu)顯示更清晰，而對(duì)胞漿和中性顆粒則染色較差。

（2）試劑

姬姆薩（Giemsa）染料1．0g甘油66．0ml甲醇66．0ml

將1．0g姬姆薩染料粉末全部倒入盛有66．0ml甘油的圓錐燒瓶?jī)?nèi)，在56℃的水浴鍋上加熱90～120分鐘，使染料與甘油充分混勻溶解，然后加入60℃預(yù)熱的甲醇，充分搖勻后置棕色瓶中，于室溫下7天，過(guò)濾后才能使用。此種染液放置時(shí)間愈久，細(xì)胞著色越佳。

（3）操作

①。將干燥血片用甲醇固定3～5分鐘。

②。將固定的血片置于被pH6．4～6．8磷酸鹽緩沖液（同瑞氏染色）稀釋10～20倍的姬姆薩染液中，浸染10～30分鐘（標(biāo)本較少可用滴染法）。

③。取出用水沖洗，待干后鏡檢。

3．瑞氏姬姆薩混合一次染色法

I液：取瑞氏染粉1g、姬姆薩染粉0．3g，置潔凈研缽中，加少量甲醇（分析純）研磨片刻，吸出上層染液。再加少量甲醇，繼續(xù)研磨，再吸出上液。如此連續(xù)幾次，共用甲醇500ml，收集于棕色瓶中，每天早、晚各振搖3分鐘，共5天，以后存放1周即能使用。

Ⅱ液：pH6．4～6．8磷酸鹽緩沖液

磷酸二氫鉀（無(wú)水）6．64g磷酸氫二鉀（無(wú)水）2．56g加少量蒸餾水溶解，用磷酸鹽調(diào)整pH，加水至1000ml.

操作平置玻片于染色架上，滴加染液3～5滴，使其迅速蓋滿血膜，約1分鐘后，滴加緩沖液5～10滴，輕輕搖動(dòng)玻片或?qū)?zhǔn)血片吹氣，與染液充分混合，5～10分鐘后用水沖去染液，待干醫(yī)`學(xué)教育網(wǎng)搜集整理。

四．血涂片的質(zhì)量控制

1．血膜片的質(zhì)量要求是厚薄均勻適度，低倍鏡下觀察全片，細(xì)胞不重疊，頭尾及兩側(cè)有一定的空隙，血膜頭部有明確的病人標(biāo)志。

2．些體積較大的特殊細(xì)胞常在血膜的尾部出現(xiàn)，因此蠟筆劃線時(shí)應(yīng)注意保存血膜尾部細(xì)胞，血膜必須充分干燥，否則在染色過(guò)程中容易脫落。

3．配制染料須用優(yōu)質(zhì)甲醇，稀釋染液用緩沖液，因?yàn)榫彌_液的pH對(duì)細(xì)胞染色的影響很重要。在偏酸性環(huán)境中正電荷增多，在偏堿性環(huán)境中負(fù)電荷增多，又因?yàn)榧?xì)胞著色對(duì)氫離子濃度十分敏感。如果染色偏堿，原是紫紅色的中性顆粒則染成深藍(lán)色，造成識(shí)別困難。沖洗須用中性水，雖亦可用自來(lái)水（但不能保持穩(wěn)定）。

4．對(duì)所用染液應(yīng)進(jìn)行預(yù)染試驗(yàn)，新配制的染液放置一段時(shí)間后其中的美藍(lán)逐漸氧化成天青B，天青B對(duì)細(xì)胞核的著色效果比美藍(lán)好，因此，瑞氏染液放置時(shí)間越長(zhǎng)染色效果越好，臨床上稱之為成熟。判斷染液成熟程度的簡(jiǎn)易方法是用正常優(yōu)質(zhì)血片做預(yù)染試驗(yàn)，先用低倍鏡觀察載有染液的血片，認(rèn)為著色滿意后，再按照染色后沖洗順序最后用油鏡鏡檢，這樣不僅可了解染液的成熟程度，而且還可以選擇合適的染色時(shí)間，供臨床標(biāo)本染色時(shí)參考。

5．染液與緩沖液的比例要適當(dāng)，以1∶27為宜。一般說(shuō)來(lái)緩沖液稀釋度愈大，染色時(shí)間愈長(zhǎng)，細(xì)胞著色愈勻稱、鮮艷。緩沖液和染液量要充足，否則染液很快蒸發(fā)，染料沉淀于細(xì)胞上，使細(xì)胞深染而無(wú)法檢查。細(xì)胞較多較厚的涂片（如紅細(xì)胞增多癥）染液應(yīng)多些。細(xì)胞較少的涂片染液應(yīng)少些。

6．染色時(shí)間與染液濃度、室溫高低、細(xì)胞多少有關(guān)，染液愈淡，室溫越低，細(xì)胞愈多，所需時(shí)間越長(zhǎng)，應(yīng)適當(dāng)增加染液濃度，因此必須根據(jù)情況靈活掌握。

7．染色良好的血膜片，外觀呈淺紅色，紅細(xì)胞呈粉紅色，白細(xì)胞核呈暗紫紅色，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)能辨，粒細(xì)胞的顆粒呈固有種異顏色。