視網(wǎng)膜色素變性新療法，關(guān)注國際眼科的您一定不能錯(cuò)過，醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)整理了相關(guān)內(nèi)容，希望對您有所幫助。

視網(wǎng)膜色素變性是一種具有明顯遺傳傾向的慢性、進(jìn)行性視網(wǎng)膜色素上皮和光感受器的變性疾病，發(fā)病率大約為四千分之一，會引發(fā)視網(wǎng)膜變性，并最終導(dǎo)致失明。這種遺傳性疾病已與超過 60 個(gè)基因（和超過 3，000 個(gè)突變）相關(guān)聯(lián)，因此為基因治療增加了難度。最近來自美國國立衛(wèi)生研究院眼科研究所的一組研究人員通過一種病毒載體直接向眼睛輸送了基于 CRISPR-as9 的治療元件，成功在視網(wǎng)膜變性小鼠中阻止了視網(wǎng)膜色素變性。

CRISPR-Cas9 基因組編輯技術(shù)給分子生物學(xué)領(lǐng)域帶來了一場變革。研究者們只需使用細(xì)菌核酸酶 Cas9 和引導(dǎo)酶切位點(diǎn)的短 RNA，就能夠在活體生物中有效敲除或者改變基因序列，這為許多疾病的治療帶來了新希望。

這一研究成果公布在 Nature Communications 雜志上，文章的通訊作者是眼科研究所的吳志堅(jiān)研究員（Zhijian Wu，音譯），第一作者為余文瀚（Wenhan Yu）博士，余文瀚博士指出，“AAV 載體是可以安全、高效地轉(zhuǎn)導(dǎo)光感受器細(xì)胞和其他一些視網(wǎng)膜細(xì)胞的成熟系統(tǒng)。它攜帶的基因能夠在光感受器細(xì)胞這種非分裂細(xì)胞中長期存在表達(dá)。它解決了將 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)安全有效傳遞到體內(nèi)的問題”。

在視網(wǎng)膜的眼后部組織中有兩種類型的細(xì)胞，能將光轉(zhuǎn)換成電信號發(fā)給大腦，視桿光感受器能在昏暗的光線下產(chǎn)生視覺，而視錐光感受器則能在光照條件下實(shí)現(xiàn)色彩視覺和觀察。遺傳突變主要影響前者，導(dǎo)致夜盲癥，就像是視網(wǎng)膜色素變性患者看到的那樣。不過由于視桿光感受器也會為視錐光感受器提供重要的結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)支持，因此視桿光感受器障礙或死亡會導(dǎo)致視錐光感受器變性和失明。

為此這項(xiàng)最新研究設(shè)計(jì)了一種 CRISPR 單導(dǎo)向 RNA（sgRNA），靶向視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)錄因子：神經(jīng)視網(wǎng)膜亮氨酸拉鏈（Nrl），Nrl 能調(diào)控視網(wǎng)膜發(fā)育過程中特殊視桿細(xì)胞的命運(yùn)，并維持成熟視網(wǎng)膜內(nèi)的視桿細(xì)胞。研究小組將 Nrl-sgRNA 和 Cas9 內(nèi)切核酸酶通過兩個(gè)單獨(dú)的腺相關(guān)病毒（AAV）載體，直接遞送到小鼠視網(wǎng)膜上。他們指出，這種 AAV 載體的優(yōu)點(diǎn)就是能維持非分裂細(xì)胞（例如視網(wǎng)膜細(xì)胞）中長期基因表達(dá)的能力。

研究人員利用基于 Cre 的重組系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)敲除 Nrl 可以將視桿細(xì)胞部分轉(zhuǎn)換類似視錐細(xì)胞，防止視桿細(xì)胞的死亡以及視網(wǎng)膜色素變性中二級視錐細(xì)胞的死亡。

余文瀚博士解釋道，“我們對接近成熟（2周）的小鼠注射 AAV-CRISPR，加上 AAV 系統(tǒng)攜帶的基因表達(dá)需要一定時(shí)間，我們判斷實(shí)際上 Cas9 蛋白表達(dá)達(dá)到峰值，系統(tǒng)真正起效的時(shí)候小鼠已經(jīng)至少 4 周大了。這時(shí)光感受器細(xì)胞已經(jīng)完全發(fā)育完成，所以視桿細(xì)胞很難再完全轉(zhuǎn)變成視錐細(xì)胞。華盛頓大學(xué) Corbo 組之前的 PNAS 文章也顯示，隨著視桿細(xì)胞的發(fā)育，一些視桿細(xì)胞特異性基因，像 Rhodopsin，其啟動子被特定修飾，在修飾以后，敲除 Nrl 基因基本對其表達(dá)沒有影響。

事實(shí)上，我們并不希望將視桿細(xì)胞真正轉(zhuǎn)變成視錐細(xì)胞（一般是轉(zhuǎn)變成 s-cone）。這種轉(zhuǎn)變在臨床上叫做“Enhanced S Cone Syndrome”，一般就與 NRL 基因突變有關(guān)系。我們沒有完全轉(zhuǎn)變恰恰提示如果我們的方法轉(zhuǎn)化到臨床以后，可能并不會導(dǎo)致與 NRL 基因突變相關(guān)疾病相同的病變。“

由于 Cre 重組方法并不適用于人體，因此研究人員轉(zhuǎn)向了 CRISPR 系統(tǒng)。“這項(xiàng)新工作獲得了兩個(gè)方面的進(jìn)步：作者采用了了一種 AAV 介導(dǎo)的 CRISPR-Cas9 遞送系統(tǒng)，可以應(yīng)用于人類患者，并且他們指出了這種策略可以在多種視網(wǎng)膜變性模型中起作用。”

研究組首先將實(shí)驗(yàn)治療載體注射到 2 周齡野生型小鼠的視網(wǎng)膜中，然后觀察小鼠在三至四個(gè)月內(nèi)的變化。與注射對照載體的小鼠相比，接受治療的小鼠 Nr1 表達(dá)量降低。在注射后第 6 周，治療小鼠視桿細(xì)胞出現(xiàn)了下調(diào)的視桿細(xì)胞基因，以及上調(diào)的視錐細(xì)胞基因。同時(shí)研究人員也指出，這種治療不會對視錐細(xì)胞產(chǎn)生任何有害作用。

接下來，研究組在三種不同的視網(wǎng)膜色素變性小鼠模型上檢測了載體，其中包括視紫紅質(zhì)基因中表達(dá)顯性人類突變的模型，之后再觀察幾個(gè)月后小鼠的變化，結(jié)果表明在所有三種情況下，治療小鼠保留了更多的視桿細(xì)胞，阻止了視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞的死亡。

去年年初，美國 Cedars-Sinai 醫(yī)學(xué)中心的研究人員利用 CRISPR-Cas9 刪除視網(wǎng)膜色素變性的遺傳突變，但是最新這項(xiàng)成果“有兩方面重要的區(qū)別：1）以前的研究一般針對單一基因突變，我們的策略理論上可以針對絕大部分視桿細(xì)胞相關(guān)基因突變引起的視網(wǎng)膜色素變性；2）以前的研究一般是在新生小鼠眼內(nèi)注射質(zhì)粒，通過 electroporation 傳遞基因，此時(shí)視網(wǎng)膜還未停止發(fā)育，一些細(xì)胞還會分裂分化；而我們的方法是用 AAV 傳遞 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)，對接近成熟（2周）或成熟（4-5周）小鼠進(jìn)行治療，主要針對非分裂細(xì)胞”，余文瀚博士說。

而且這一策略理論上可以針對大多數(shù)基因相關(guān)的 RP，“但是我們的 AAV-CRISPR 系統(tǒng)確實(shí)也可以靶向其他的基因。目前更容易達(dá)到的策略是敲除顯性致病基因，類似的研究已經(jīng)有報(bào)道。當(dāng)然，未來隨著技術(shù)的發(fā)展，我們希望能夠有一天實(shí)現(xiàn)基因修復(fù)。”

不過在人體進(jìn)行檢測之前，還需要回答幾個(gè)問題，比如 Cas9 的長期表達(dá)是否對視網(wǎng)膜有害，以及 Nrl 的消除在人體中是否能有小鼠中相同的效果。

佛羅里達(dá)大學(xué)的 Shannon Boye 評論道，“還需要更多的研究來確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但這些研究對于分析 CRISPR-Cas9 在有絲分裂后神經(jīng)元中的作用方面令人鼓舞。”

余文瀚博士說，“我們只是走了一小步，證明了這個(gè)策略的可行性和有效性。我們認(rèn)為要真正實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用，主要要解決安全性問題，首先要解決CRISPR的安全性，主要是 off-target 效應(yīng)。我們的研究在 10 個(gè)可能的 off-target 位點(diǎn)并沒有發(fā)現(xiàn)突變，但不能排除其他位點(diǎn)可能發(fā)生了突變；醫(yī)學(xué)教育|網(wǎng)搜集整理也有人認(rèn)為在體內(nèi)由于種種原因不容易產(chǎn)生或積存 off-target 事件，但因?yàn)?Cas9 的持續(xù)表達(dá)，隨著時(shí)間推移這種可能性理論上會越來越大。我們期待隨著更特異、可控的 CRISPR 系統(tǒng)的出現(xiàn)，這個(gè)問題可以得到解決。其次是策略本身的安全性，也就是我前面提到的NRL基因突變相關(guān)疾病的問題，雖然我們的結(jié)果表明在視桿細(xì)胞發(fā)育完成以后敲除 Nrl 不會將視桿細(xì)胞完全轉(zhuǎn)化成視錐細(xì)胞，提示可能并不會引起相關(guān)的病變，但這個(gè)策略本身的安全性還需要在跟人類進(jìn)化關(guān)系更近的靈長類動物上進(jìn)行驗(yàn)證。”

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