【摘要】  目的 研究灌服中藥扶正解毒湯（FJD）后兔血清對硫酸鎳（NiSO4）暴露的人支氣管上皮細(xì)胞（16HBE）自由基含量及8羥基2脫氧鳥苷三磷酸酶（8oxodGTPase）表達(dá)的影響。方法 體外培養(yǎng)的16HBE細(xì)胞分別經(jīng)NiSO4暴露及NiSO4加扶正解毒湯含藥血清共同處理后，采用激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）及實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR檢測自由基含量及8oxodGTPase表達(dá)的變化。結(jié)果 NiSO4（800μmol/L）暴露的16HBE細(xì)胞，其自由基含量及8oxodGTPase表達(dá)水平均高于NiSO4與扶正解毒湯（10%）共處理組細(xì)胞，Ｐ＜005～001，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）＞2%.結(jié)論 8oxodGTPase可作為鎳暴露氧化應(yīng)激的標(biāo)記物；中藥扶正解毒湯通過清除自由基，下調(diào)8oxodGTPase的表達(dá)，對鎳暴露氧化損傷具有顯著的抑制作用。

　　【關(guān)鍵詞】  扶正解毒湯

　　本課題組多年進(jìn)行的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及職業(yè)病臨床研究表明，中藥扶正解毒湯（FJD）具有良好地拮抗鎳毒性的作用〔1，2〕。本文從體外途徑研究了中藥解毒湯對硫酸鎳（NiSO4）暴露的人支氣管上皮（16HBE）細(xì)胞內(nèi)自由基含量及8羥基2脫氧鳥苷三磷酸酶（8oxodGTPase）表達(dá)的影響，旨在為該復(fù)方的作用機(jī)制補(bǔ)充新的資料。

　　1  材料與方法

　　11  材料

　　111  細(xì)胞及動(dòng)物16HBE細(xì)胞（美國ATCC公司）。純種青紫蘭兔8只，雄性，體重（21±03）kg（中國蘭州生物制品研究所），合格證號：14004，常規(guī)飼養(yǎng)。

　　112  中藥  扶正解毒湯由紅芪、當(dāng)歸、丹參、枸杞等組成，以三蒸水煎煮，過濾、濃縮成含生藥4g/ml的溶液，高溫高壓消毒滅菌，密封，4℃以下儲存?zhèn)溆谩?/P>

　　113  主要試劑及設(shè)備  基礎(chǔ)培養(yǎng)液（MEM）培養(yǎng)基、Trizol試劑盒（美國GIBCO公司）；小牛血清（杭州四季青生物工程材料公司）；乙酰乙酸鹽2，7二氯氫化熒光素（D399）（美國Molecular Probes公司）；ExScripＴＭRT reagent Kit及SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（日本TaKaRa公司）；TCS sp2型激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)（德國Leica公司）；Smart Cycler ⅡSystem熒光定量PCR儀（美國PE公司）。人類human NutT homologue （hMTH1）基因PCR引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)〔３〕。分別為P1：5′CTTCTCTGCGCCACTCAA3′，P2：5′GAGCGGCGGTGCAGAACC3′；預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段177bp.βactin引物為P1：5′TTGCGCTCAGGAGCAAT3′，P2：5′TTCCAGCCTTCCTTCCTGG3′；預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段223bp（寶生物工程有限公司合成）。

　　12  方法

　　121  扶正解毒湯血清凍干粉制備  以中藥扶正解毒湯12g/kg每天分2次給兔等體積灌胃，空白對照組予以生理鹽水（灌胃前均禁食，自由取水），共3d.于末次灌胃后2h心臟采血，按文獻(xiàn)〔4〕方法制備扶正解毒湯血清及空白血清凍干粉。

　　122  細(xì)胞培養(yǎng)及受試物處理  16HBE細(xì)胞用含10%小牛血清、青霉素及鏈霉素的MEM培養(yǎng)基于37℃，5%CO２飽和濕度的環(huán)境中培養(yǎng)。試驗(yàn)時(shí)以不含小牛血清的MEM培養(yǎng)液將細(xì)胞調(diào)至1×104/ml，按以下分組分別處理：（1）NiSO4組：NiSO4以無血清MEM培養(yǎng)液溶解，終濃度800μmol/L（預(yù)試驗(yàn)中，NiSO4≥800μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率驟降至60%以下，故以800μmol/L作為此試驗(yàn)濃度）。（2）扶正解毒湯+NiSO4Ⅰ組：NiSO4染毒前4h加入扶正解毒湯血清，終濃度為10%（體積分?jǐn)?shù)），再加入NiSO4（800μmol/L）。（3）扶正解毒湯+NiSO4Ⅱ組：同時(shí)加入扶正解毒湯與NiSO4.（4）空白血清對照（簡稱空白血清）+NiSO4組：同時(shí)加入空白血清與NiSO4.終濃度均同（2）。（5）空白血清組：加入空白血清（10%）。（6）陰性對照組：MEM培養(yǎng)液。

　　123  細(xì)胞存活率檢測  以常規(guī)臺盼藍(lán)計(jì)數(shù)法檢測各組細(xì)胞存活率，每組共計(jì)數(shù)250個(gè)細(xì)胞。

　　124  細(xì)胞內(nèi)自由基含量檢測  在加入NiSO416h后，將收集的各組細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，取D399（5μg/ml）1ml，加至各細(xì)胞懸液中，按文獻(xiàn)〔5〕方法以激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）檢測16HBE細(xì)胞內(nèi)自由基含量（以平均熒光強(qiáng)度表示）。

　　125  RNA提取、cDNA合成及標(biāo)準(zhǔn)定量模板的制備  在進(jìn)行自由基含量測定的同時(shí)，另收集各組細(xì)胞，按Trizol試劑盒說明，提取各組總RNA，測定A260，A280的吸光度值，計(jì)算出RNA的含量，并按ExScriptTMRT reagent Kit操作說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，置于-80℃保存?zhèn)溆谩毶锕こ逃邢薰緲?gòu)建的hMTH1及βactin定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒利用各自的引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，制備6個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)模板，分別定義為101～106拷貝數(shù)/μl，-20℃保存?zhèn)溆谩?/P>

　　126  SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)  根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒說明，設(shè)定反應(yīng)擴(kuò)增條件，將6組實(shí)驗(yàn)樣品與不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)模板同時(shí)進(jìn)行PCR.重復(fù)3次。將檢測的臨界點(diǎn)設(shè)定在擴(kuò)增過程中，熒光信號由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的拐點(diǎn)所對應(yīng)的循環(huán)數(shù)（threshold cycle，CT）作為模板初始濃度的間接指標(biāo)，將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)模板拷貝的對數(shù)相應(yīng)的CT值作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

　　127  8oxodGTPase（hMTH1 mRNA）表達(dá)的相對定量分析  將得到的各組hMTH1基因及βactin基因的值分別代入各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線，換算出各自的起始模板量。以βactin作為參比基因?qū)λ袠悠愤M(jìn)行RNA校正，用hMTH1基因的定量結(jié)果除以βactin定量結(jié)果即可得到校正值。以陰性對照組hMTH1 mRNA的表達(dá)量作為“1”，再根據(jù)校正值計(jì)算出其他各組的相對量，進(jìn)行組間相對量的比較。

　　13  統(tǒng)計(jì)分析  采用SPSS 100統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析；組間差異用t檢驗(yàn)及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）檢驗(yàn)（以RSD＞2%為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。

　　2  結(jié)果

　　21  細(xì)胞存活率  經(jīng)臺盼藍(lán)計(jì)數(shù)，各組的細(xì)胞存活數(shù)均不低于90%，且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　22  LSCM檢測結(jié)果（表1，圖1A～Ｃ）  NiSO4染毒后16h，細(xì)胞D399平均熒光強(qiáng)度（自由基含量）明顯增強(qiáng)，扶正解毒湯血清與NiSO4共處理各組D399平均熒光強(qiáng)度顯著低于NiSO4組（Ｐ＜005～001）；空白血清對染鎳細(xì)胞內(nèi)自由基含量變化無影響。

　　表1  扶正解毒湯血清對染鎳16HBE內(nèi)自由基含量變化的影響（略）

　　注：與陰性對照組比較，a Ｐ＜005；與NiSO4組比較，b Ｐ＜005，c Ｐ＜001

　　A：NiSO4組  B：扶正解毒湯+NiSO4（Ⅰ）組   C：扶正解毒湯+NiSO4（Ⅱ）組

　　圖1  LSCM下16HBE細(xì)胞內(nèi)D399熒光強(qiáng)度（×40）（略）

　　23  實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線分析  hMTH1和βactin定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率分別為-10388和-11021，r2分別為09990和09966.表明線性關(guān)系良好，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)能夠進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

　　24  扶正解毒湯血清對染鎳細(xì)胞８oxodGTPase（hMTH1 mRNA）表達(dá)的影響（表2）  與陰性對照組比較，NiSO4染毒組細(xì)胞８oxodGTPase表達(dá)明顯增強(qiáng)（RSD=58%），且空白血清對此結(jié)果無影響；而扶正解毒湯+NiSO4Ⅰ組、扶正解毒湯+NiSO4Ⅱ組細(xì)胞８oxodGTPase表達(dá)水平則明顯低于NiSO4組（RSD分別為67%，63%）。

　　3  討論

　?。釜瞣xodGTPase由hMTH1基因編碼，可催化DNA氧化損傷產(chǎn)物8羥基2脫氧鳥苷三磷酸（８oxodGTP）的水解，從而阻止后者向DNA的錯(cuò)誤摻入，減少突變。故被視為一種內(nèi)源性抗氧化、抗突變酶〔6〕，又可作為一種氧化應(yīng)激的標(biāo)記物〔3〕。鎳化合物可通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激等途徑產(chǎn)生一系列細(xì)胞遺傳毒性，甚至癌變〔7，8〕。本研究發(fā)現(xiàn)，NiSO4（800μmol/L）暴露16HBE細(xì)胞16h，其自由基含量及８oxodGTPase表達(dá)均明顯增強(qiáng)，間接證實(shí)了鎳暴露16HBE細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的存在，同時(shí)也證明了８oxodGTPase作為氧化應(yīng)激標(biāo)記物的作用。16HBE細(xì)胞經(jīng)扶正解毒湯血清與NiSO4共同處理后，其自由基明顯降低，而８oxodGTPase的表達(dá)水平則無明顯增加。提示扶正解毒湯可能通過預(yù)防或直接清除方式而減少染鎳細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生，發(fā)揮體外抗氧化作用，此與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致〔９，１０〕。同時(shí)亦可認(rèn)為，扶正解毒湯與NiSO4共處理組細(xì)胞內(nèi)８oxodGTPase表達(dá)的下調(diào)，并非扶正解毒湯血清直接作用的結(jié)果，而正是由于扶正解毒湯對ROS迅速而有效的清除，使得該氧化應(yīng)激標(biāo)記物的“預(yù)警”效應(yīng)處于低或不應(yīng)答狀態(tài)，從而反證了扶正解毒湯的抗氧化作用。有關(guān)扶正解毒湯抗鎳暴露氧化損傷的具體機(jī)制還需進(jìn)一步探討。

　　表2  不同處理組細(xì)胞hMTH1 mRNA表達(dá)的相對量比較（略）

　　注：與陰性對照組比較，a RSD=58%；與NiSO4組比較，b RSD=67%，c RSD＝63%

　　【參考文獻(xiàn)】〔1〕 趙健雄，寧守斌，朱玉真，等。中藥防治硫酸鎳致肝腎損傷實(shí)驗(yàn)研究［J］。衛(wèi)生毒理學(xué)雜志，2004，14（4）：240-241.

　　〔2〕 呂曉云，趙健雄，滕玉蓮。扶正解毒顆?？规嚤┞?a href="http://pardusfixedincomebond.com/jibing/gansunshang/" target="_blank" title="肝損傷" class="hotLink">肝損傷31例臨床研究［J］。中醫(yī)雜志，2005，46（12）：910-912.

　　〔3〕 Frauke M，Emerich F，Johannes W.Induction of ８oxodGTPase activity in human lymphoid cells and normal fibrobiasts by oxidative stress［J］。Toxi，2004，146（2-3）：83-92.

　　〔4〕 李儀奎。中藥新藥研究與開發(fā)［M］。上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2000：324-329.

　　〔5〕 郭芙蓮，趙健雄，白德成，等。扶正抑瘤顆粒對小鼠肝癌細(xì)胞（H２２）DNA、RNA及自由基含量的影響［J］。四川中醫(yī)，2006，24（5）：20-22.

　　〔6〕 Tsuzuki T，Tominaga Y.Recent studies on mammalian DNA repair mechanisms［J］。Noppon Rinsho，1995，53（6）：1537-1547.

　　〔7〕 Kasprzk KS，Sunderman FW Jr，Salnikow K.Nickelcarcinogenesis［J］。Mutat Res，2003，533（1-2）：67-97.

　　〔8〕 Costa M，salnikow K，Sutherland JE，et al.The role of oxidative stress in nickel and chromate genotoxicity［J］。Mol Cell Biochme，2002，234/235：265-275.

　　〔9〕 呂曉云，趙健雄，朱玉真，等。中藥對鎳暴露者肝損傷時(shí)脂質(zhì)過氧化作用的研究［J］。中華實(shí)用中西醫(yī)雜志，2003，16（1）：109-111.

　　〔10〕 朱玉真，趙健雄，王學(xué)習(xí)，等。硫酸鎳致大鼠脂質(zhì)過氧化作用及中醫(yī)藥防治作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］。中華實(shí)用中西醫(yī)雜志，2001，14（19）：1445-1446.