【摘要】  目的：研究高密度脂蛋白（HDL）抗內(nèi)毒素，保護(hù)肝細(xì)胞作用。 方法：用超離心方法分離純化血漿脂蛋白，建立內(nèi)毒素血癥急性肝衰竭小鼠模型，觀察HDL處理后各組肝衰竭小鼠的存活率及主要臟器的組織學(xué)改變，RTPCR檢測小鼠肝細(xì)胞TNFα和IL6 mRNA表達(dá)水平。 結(jié)果：HDL對(duì)內(nèi)毒素及半乳糖胺所致小鼠肝衰竭有明顯保護(hù)作用，治療組存活率明顯高于對(duì)照組（85％ vs 15%）；內(nèi)毒素血癥肝衰竭小鼠肝臟發(fā)生了廣泛的變性壞死，而HDL治療組小鼠肝細(xì)胞僅發(fā)生了輕微變性壞死，單純無脂蛋白血漿（LFF）則無此保護(hù)作用；內(nèi)毒素小鼠肝組織TNFα和IL6 mRNA表達(dá)水平增高，HDL治療組TNFα和IL6 mRNA表達(dá)水平接近正常。 結(jié)論：HDL具有抗內(nèi)毒素血癥保護(hù)小鼠肝細(xì)胞，預(yù)防肝衰竭的作用。 其作用機(jī)制可能是通過降低肝衰竭小鼠TNFα和IL6的過度表達(dá)而發(fā)揮作的。

　　【關(guān)鍵詞】  脂蛋白類；內(nèi)毒素；肝衰竭，細(xì)胞因子

　　0引言

　　高密度脂蛋白（highdensitylipoprotein， HDL）顆粒小，蛋白質(zhì)含量高，主要為apoAⅠ，Levels等［1］報(bào)道HDL可以介導(dǎo)細(xì)菌內(nèi)毒素清除和脫毒。 內(nèi)毒素血癥與肝損害互為因果，在重型肝炎發(fā)病中具有重要作用。 但至今臨床上尚無真正的抗內(nèi)毒素藥物。 我們用人血漿純化HDL治療急性肝功能衰竭小鼠內(nèi)毒素血癥， 觀察其對(duì)肝臟的保護(hù)作用， 并進(jìn)一步研究其機(jī)制。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　正常人新鮮血漿200 mL，密度梯度離心（日立CP100MX型超速離心機(jī)）收集密度在1.063～1.21 g/cm3的HDL部分，透析濃縮后考馬斯亮藍(lán)測定蛋白含量。 另外取最底層無脂蛋白血漿部分（LFF，d＞1.21）透析濃縮。  HDL純度鑒定采用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法  分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為6%，血漿超離心各種脂蛋白層各取25 μL加SDS制備樣品，點(diǎn)樣，恒流20 mA，樣品進(jìn)入分離膠后恒流30 mA，電泳3 h 30 min.

　　1.2方法

　　Babl/c小鼠（購于中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）60只，體質(zhì)量（18±2） g，隨機(jī)分為3組，每組20只，雌雄各半，每只小鼠ip內(nèi)毒素LPS（來自大腸桿菌血清型O55∶B5，Sigma） 15 mg/kg和半乳糖胺（GalN， Sigma） 500 mg/kg混合液（總體積500 μL）。 治療組分別于造模前0.5 h及造模后1，2，4 h尾靜脈iv HDL+LFF（37℃預(yù)培育3 h）注射劑量HDL 40 mg/kg，LFF 5 mL/kg；LFF對(duì)照組注射LFF 5mL/kg；生理鹽水對(duì)照組注射等量生理鹽水。 連續(xù)72 h觀察小鼠存活情況。  取小鼠適量肝、脾、腎、肺、心、腦組織用40 g/L的甲醛溶液固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，HE染色。 另剪取新鮮瘤組織50 mg，加Trizo1（GIBCO公司） 1 mL，充分勻漿后按照說明書步驟提取總RNA，以其為模板嚴(yán)格按反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega）說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后， PCR擴(kuò)增體系參照文獻(xiàn)［2］，以βactin為內(nèi)參照。  PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像分析儀（GELDOCL1000型）分析，所用引物是根據(jù)基因庫中小鼠cDNA序列應(yīng)用Oligo軟件自行設(shè)計(jì)，由上海生物工程公司合成（表1）。表1PCR擴(kuò)增的引物序列、片段長度、退火溫度及循環(huán)數(shù)

　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用χ2檢驗(yàn)。 P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　2結(jié)果

　　SDSPAGE顯示各種脂蛋白（VLDL，LDL，HDL）分離完全，表明采用超速離心法從人血漿純化HDL的純度和特異性均好。

　　2.1HDL對(duì)小鼠肝衰竭的保護(hù)作用

　　HDL+LFF具有顯著抗內(nèi)毒素及半乳糖胺致死作用，而單純LFF抗致死作用不明顯。 各組小鼠死亡率分別為：模型組為85%，LFF對(duì)照組為80%，HDL治療組15%（χ2=13.65，P<0.001）。  模型組小鼠肝細(xì)胞混濁腫脹，大量肝細(xì)胞壞死，肝竇及匯管區(qū)炎細(xì)胞浸潤，心、腦、肺、脾、腎組織學(xué)未見明顯異常。 LFF對(duì)照組病理改變與模型組類似。 而HDL治療組小鼠肝細(xì)胞僅見肝細(xì)胞混濁腫脹等變性和輕微壞死（圖1）。A： 模型組； B： LFF對(duì)照組； C： HDL治療。

　　2.2HDL對(duì)肝衰竭小鼠肝細(xì)胞因子的影響

　　模型組肝組織TNFα和IL6 mRNA表達(dá)水平增高，LFF對(duì)照組與模型組無差異，HDL治療組TNFα和IL6 mRNA表達(dá)水平接近正常小鼠（圖2）。

　　3討論

　　內(nèi)毒素含脂質(zhì)A，脂蛋白是體內(nèi)脂質(zhì)運(yùn)載的工具，因此，脂蛋白可以結(jié)合內(nèi)毒素，是天然存在的細(xì)胞外LPS清除劑。  本研究顯示HDL能顯著降低內(nèi)毒素所致肝功能衰竭小鼠的死亡率。 模型組小鼠肝臟發(fā)生廣泛變性壞死，腎、脾、心、腦組織未見類似改變，與文獻(xiàn)報(bào)道用半乳糖胺敏化內(nèi)毒素選擇性誘導(dǎo)小鼠肝功能衰竭相一致［3］，LFF對(duì)照組小鼠肝臟組織學(xué)改變與模型組相似，HDL+LFF治療組小鼠肝臟僅見輕微變性壞死；DNA片斷化分析模型組小鼠肝細(xì)胞DNA呈現(xiàn)凋亡特征性梯狀條帶，而HDL治療組則無此改變，說明肝細(xì)胞凋亡也是內(nèi)毒素所致肝功能衰竭的一種重要病理形式。 Johnston等［4］研究表明，C57BＬ/6小鼠吸入LPS能夠誘導(dǎo)肺組織產(chǎn)生強(qiáng)烈的中性粒細(xì)胞反應(yīng)，使TNFα，IL1β，IL6，IFN，MIP1等mRNA表達(dá)水平上升， 本研究亦顯示ipLPS也能夠誘導(dǎo)肝臟高表達(dá)TNFα和IL6，表明這些炎性細(xì)胞因子在急性肝衰竭的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。 HDL治療組TNFα和IL6表達(dá)水平下降，可能與HDL結(jié)合血液中的內(nèi)毒素，減輕肝細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，起到保護(hù)肝臟的作用有關(guān)。

　　HDL起作用需要無脂蛋白血漿中某些成分參與。 van Leeuwen等［5］報(bào)道血漿中存在一種LBP（LPSbinding protein），促進(jìn)LPS與HDL結(jié)合。 在正常情況下LPS與HDL結(jié)合在一起，但超離心制備HDL時(shí)，在較強(qiáng)外力的作用下LBP從HDL中分離出來，分布到d＞1.21個(gè)g/cm3部分［6］。 在我們實(shí)驗(yàn)中用超離心法制備HDL，使LBP解離而喪失結(jié)合LPS的作用，因此，在實(shí)驗(yàn)中加入LFF后可使HDL恢復(fù)結(jié)合LPS的能力，發(fā)揮保護(hù)肝細(xì)胞的作用。 本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了血漿中的HDL是結(jié)合LPS的主要成分，介導(dǎo)了LPS清除和脫毒，其確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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