【摘要】  目的：觀察己酮可可堿（PTX）對大鼠潰瘍性結(jié)腸炎（UC）模型的治療作用，探討血栓及血栓前狀態(tài)（PTS）在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病中的作用和己酮可可堿作用機制。 方法：用2，4，6三硝基苯磺酸（TNBS）造大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，將大鼠模型隨機分為模型組，模型+生理鹽水組，模型+己酮可可堿組，另設(shè)空白對照組，共4組。 觀察各組大鼠腸道大體形態(tài)和組織學改變；采用血小板黏附儀檢測血小板黏附功能（ PAdT），智能血液凝聚儀檢測血小板的聚集功能（PAgT）；ELISA法測定血清中的血栓烷B2（ TXB2）；單克隆酶聯(lián)吸附法檢測血管性假血友病因子相關(guān)抗原（vWF∶Ag）；酶聯(lián)免疫吸附法檢測細胞內(nèi)粘附因子1（ICAM1）。 結(jié)果：與模型+生理鹽水組比較，模型+己酮可可堿組損傷指數(shù)下降（6.02±0.74 vs 0.85±0.50， P<0.01； 5.68±0.60 vs 1.08±0.45， P<0.01）；模型組血小板黏附率和聚集率與空白對照組無明顯增加（P>0.05）； 模型組TXB2， vWF∶Ag， ICAM1均較空白對照組的差異無統(tǒng)計學意義（P<0.01），經(jīng)己酮可可堿治療后，均較模型+生理鹽水組降低（P<0.05）。 結(jié)論：TNBS所誘導大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型與PTS有一定關(guān)系。 PTX通過抗凝、抗炎癥介質(zhì)、抗細胞因子而發(fā)揮治療UC作用。

　　【關(guān)鍵詞】  己酮可可堿；結(jié)腸炎，潰瘍性；血小板功能試驗；炎癥介質(zhì)；細胞因子

　　0引言

　　潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis， UC）發(fā)病機制尚未明確，在活動期腸粘膜呈彌漫性充血水腫，且有出血點、潰瘍存在。 UC與血栓及血栓前狀態(tài)有密切的關(guān)系，并應(yīng)用肝素治療取得一定療效［1-2］。 抗凝常用藥己酮可可堿毒副作用小，使用安全，有抗血小板、抗脂質(zhì)過氧化、免疫抑制作用等，因此可能對UC具有一定的抗炎作用。 本研究旨在探討己酮可可堿對大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型的治療作用及其作用機理。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　健康SD大鼠（由上海實驗動物中心提供） 60只，雄性，體質(zhì)量150～200 g，正常喂養(yǎng)； 2，4，6三硝基苯磺酸（TNBS）為Sigma公司產(chǎn)品，血管性假血友病因子相關(guān)抗原（vWF∶Ag）， 血栓烷B2 （TXB2）檢測試劑盒，由蘇州大學醫(yī)學院血栓與止血研究室提供；細胞內(nèi)粘附分子1（ICAM1）試劑盒購自華美公司。 SH293智能血液凝聚儀（購自上海生化儀器廠） ，血小板粘附兩用儀（無錫電子儀器二廠產(chǎn)）；己酮可可堿（PTX）（上海第十六制藥廠提供）。

　　1.2方法

　　1.2.1動物分組及處理

　　將60只大鼠隨機分為正常對照組（簡稱N組）， 模型組（簡稱M組）， 模型+生理鹽水組（簡稱NS組），模型+己酮可可堿組（簡稱PTX組）。 正常對照組、模型組各20只，其余每組10只。 正常對照組不作任何處理。

　　1.2.2大鼠UC模型的建立及處理

　　SD大鼠術(shù)前禁食24 h，自由飲水，實驗時乙醚麻醉，用一直徑2.0 mm， 長約12 cm的硅膠管由肛門輕緩插入深約8 cm，實驗各組以含150 mg/kg TNBS的等體積乙醇溶液0.5 mL緩慢注入結(jié)腸，讓動物保持平躺，自然清醒。 模型造成后（第4日），N組、M組各隨機選10只大鼠，禁食兩天后斷頸處死，處死前穿刺心臟取血，每只約2~3 mL，凍存?zhèn)溆?，所?0只正常喂養(yǎng)。 NS組以生理鹽水2 mL/次，PTX組按8 mg/kg（溶解于2 mL生理鹽水中）灌胃，2次/d. 3 wk各組大鼠全部處死，處死前穿刺心臟取血，每只約2~3 mL，凍存?zhèn)溆谩?所有處死大鼠，剖取遠端結(jié)腸8 cm，沿縱軸切開，生理鹽水迅速沖凈，置于標本體積10倍以上的甲醛溶液中固定。

　　1.2.3結(jié)腸粘膜損傷評分

　　大體形態(tài)評分：將福爾馬林固定后的結(jié)腸標本腸粘膜層向上平鋪于硬紙板上，用大頭針固定，并保持在生理鹽水中，用放大鏡觀察粘膜急性損傷程度，并按下列標準評分：0分：無損傷；1分：局部充血、水腫但未出現(xiàn)潰瘍；2分：有潰瘍，但沒有明顯炎癥；3分：有潰瘍，僅有一處出現(xiàn)炎癥；4 分：有多處潰瘍和炎癥，潰瘍大小<1 cm；5分：有多處潰瘍和炎癥：至少有一處潰瘍大小>1 cm. 組織學損傷評分：包括潰瘍炎癥肉芽腫、纖維化，按有無及輕重計為0，1，2 分，病變深度（達粘膜下層1分，肌層2分，漿膜層3分） 各項相加得總分。

　　1.2.4血清指標檢測方法

　　采用ELISA法檢測TXB2，單克隆酶聯(lián)吸附法檢測vWF∶Ag，酶聯(lián)免疫吸附法檢測ICAM1（均按試劑盒說明）。 血小板粘附兩用儀檢測血小板粘附功能（PAdT）， 32 g/L枸櫞酸鈉按1∶9抗凝；用SH293智能血液凝聚儀檢測血小板的聚集功能（PAgT），用2 μmol/L二磷酸腺苷作誘導劑，測定最大聚集率。

　　統(tǒng)計學處理：實驗結(jié)果以x±s表示，采用SPSS 10.0軟件包進行方差分析及多重比較。

　　2結(jié)果

　　2.1一般情況

　　大鼠造模型1 d后，開始逐漸出現(xiàn)懶動、拱背、厭食、大便次數(shù)增多、軟便或稀便、大便末端有粘液或膿點等表現(xiàn)。 3 d后癥狀達到高峰，大鼠毛色無華、變脆，嗜臥扎堆，大便完全為稀便，帶膿血。 N組大鼠無腹瀉、懶動等異常改變。

　　2.2腸組織大體形態(tài)

　　造模型3 d后，M組處死大鼠結(jié)腸標本表現(xiàn)為黏膜充血、水腫、潰瘍形成，結(jié)腸組織與周圍組織粘連。 而N組結(jié)腸標本粘膜光滑，無潰瘍，腺體排列整齊（圖1A，B）。

　　2.3PTX對大鼠潰瘍性結(jié)腸炎大體形態(tài)及組織學損傷的影響M組組大鼠結(jié)腸標本表現(xiàn)為黏膜充血、水腫、潰瘍形成，結(jié)腸組織與周圍組織粘連，可見近端腸腔擴張。 潰瘍呈線狀和灶狀，周圍可見黏膜增厚、腸腔狹窄。 光鏡下可見潰瘍及炎性滲出物，可見上皮細胞壞死、脫落，有淋巴組織增生，大量中性粒細胞浸潤，可見數(shù)量不等的單個核細胞和嗜酸性粒細胞，也可見增生的纖維母細胞。 PTX組黏膜水腫少見，無潰瘍和炎性滲出物，光鏡下腺體排列整齊， 僅見少量淋巴細胞和中性粒細胞浸潤，損傷指數(shù)低于模型組及生理鹽水組（P<0.01， 表1，圖2A，B）。表1各組大鼠結(jié)腸大體形態(tài)和組織學損傷評分比較（略）

　　2.4血小板黏附功能、聚集功能的變化

　　造模3 d N組和M的PadT， PagT差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。 3 wk后，N組和M組的PAdT， PAgT有統(tǒng)計學差異（P<0.05），模型組增高；經(jīng)不同干預(yù)，NS組血小板黏附功能、聚集功能明顯增高，而PTX組無統(tǒng)計學變化，兩組比較有統(tǒng)計學差異（P<0.05， 表2）。A： 生理鹽水處理組； B： 己酮可可堿處理組。表2大鼠潰瘍性結(jié)腸炎血小板黏附功能、聚集功能及PTX的影響（略）

　　2.5大鼠潰瘍性結(jié)腸炎TXB2， vWF∶Ag及ICAM1含量變化造模3 d M組（3 d）的TXB2， vWF∶Ag及ICAM1含量較N組（3 d）增高；3 wk后，M組3項指標的增加量更大，經(jīng)不同干預(yù)，PTX組較NS組明顯降低（表3）。表3大鼠潰瘍性結(jié)腸炎TXB2， vWF∶Ag及ICAM1含量變化及PTX的影響（略）

　　3討論

　　臨床研究發(fā)現(xiàn)，UC患者活動期腸粘膜呈彌漫性充血水腫，且有出血點，腸系膜血管可出現(xiàn)多灶性的微梗死，發(fā)生血小板栓塞性疾病的概率比正常人高，這可能與患者體內(nèi)血小板處于激活狀態(tài)密切相關(guān)［3］。 傳統(tǒng)上認為炎癥與血栓形成是兩個互相獨立的病理過程。 近來研究發(fā)現(xiàn)［4］炎癥與血栓形成之間存在著密切的聯(lián)系，現(xiàn)已公認體內(nèi)炎癥凝血之間存在網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。 本實驗采用TNBS灌腸造UC模型的方法，造模3 d隨機處死模型組和正常對照組大鼠各10只，檢測大鼠血清血小板黏附率和聚集率，結(jié)果顯示兩組之間無明顯差異；而檢測標志血小板活化大鼠血清TXB2， vWF∶Ag含量，兩組則有統(tǒng)計學差異。 UC發(fā)病過程，血小板不僅參與血栓形成，其作為炎癥細胞可直接引起炎癥反應(yīng)。 活化的血小板可釋放多種炎癥介質(zhì)，如血栓素、血小板活化因子等。 TXB2， vWF∶Ag含量增高，既標志血小板活化，又代表脂質(zhì)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，引起炎癥反應(yīng)，導致組織損傷。 之所以造模初期血小板黏附率和聚集率無明顯變化，分析認為，可能與造模初期血小板未被完全激活，尚不能影響血小板黏附率和聚集率有關(guān)。

　　本研究應(yīng)用己酮可可堿干預(yù)UC大鼠模型，其作用明顯優(yōu)于生理鹽水模型組，大鼠結(jié)腸大體形態(tài)和組織學損傷評分，PTX組和NS組比較有顯著性差異。 己酮可可堿主要作用是抑制血小板聚集，進而可減少血小板之間以及血管內(nèi)皮的粘附與聚集，能改善高凝狀態(tài)抑制血栓形成。 同時抑制血小板活化可減少脂質(zhì)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生從而阻止組織細胞損傷［5-6］。 PTX可以降低中性粒細胞（PMN）的粘附聚集能力，抑制PMN的膜補體C3受體的表達，起到免疫抑制作用［7］。 本實驗顯示，己酮可可堿可明顯抑制大鼠血清血小板黏附率和聚集率，降低大鼠血清TXB2，vWF∶Ag和ICAM1含量。 認為己酮可可堿可通過抗凝、抗炎癥介質(zhì)、抗炎癥免疫而達到治療UC作用。

　　【參考文獻】［1］Webberley MJ， Hart MT， Melikian V. Thromboembolism in inflammatory bowel Disease： Role of platelets［J］。 Gut， 1993，34：247-251.

　?。?］賀國斌，歐陽欽，陳岱云，等。 潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸組織微血栓形成的研究［J］。中國內(nèi)鏡雜志，2003，9（7）：34-36.

　?。?］魏艷靜，卞紅磊，武會珍。潰瘍性結(jié)腸炎患者體內(nèi)血小板功能狀態(tài)研究［J］。 臨床薈萃， 2003，18（11）：608-609.

　　［4］張卉，賀蓉，賀石林。炎癥與血栓形成［J］。 中華醫(yī)學雜志，2004，84（9）：784-786.

　?。?］崔海宏，陳村龍，王繼德，等。 潰瘍性結(jié)腸炎患者腸粘膜中趨化因子和核轉(zhuǎn)錄因子的變化［J］。 第四軍醫(yī)大學學報，2003，24（10）：923-925.

　?。?］陳劍鴻，陳韜，劉松青，等。 己酮可可堿對血管內(nèi)皮細胞炎性反應(yīng)的影響［J］。中國醫(yī)院藥學雜志，2003，23（7）：407-409.

　?。?］Coimbra R， Loo W， Melbostad H. LPSStimulated PMN activation and proinflammatory mediator synthesis is downregulated by phosphodiesterase inhibition：Role of pentoxifylline［J］。 J Trauma， 2004， 57（6）：1157-1162.