【摘要】  目的：應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建pIHsp65GM雙順反子真核表達(dá)質(zhì)粒，并在真核細(xì)胞中表達(dá)。 方法：以結(jié)核分枝桿菌H37Rv株基因組為模板經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增出Hsp65基因，同時(shí)從質(zhì)粒pORFhGMCSF中擴(kuò)增出基因佐劑hGMCSF，分別克隆到真核表達(dá)載體pIRES的多克隆位點(diǎn)A（MCSA）和B（MCSB）中，構(gòu)建pIHsp65GM真核表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞中表達(dá)和檢測。 結(jié)果：酶切鑒定提示插入的基因片段大小分別為1.64 kb和0.47 kb，測序分析表明克隆的Hsp65和hGMCSF序列與GenBank上公布序列完全一致；免疫組織化學(xué)方法檢測到表達(dá)Hsp65的陽性細(xì)胞；ELISA方法檢測到pIHsp65GM轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)上清中hGMCSF的表達(dá)，與空載體對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。 結(jié)論：成功構(gòu)建和表達(dá)了pIHsp65GM質(zhì)粒，為研制優(yōu)于卡介苗的新型抗結(jié)核病DNA疫苗奠定基礎(chǔ)。

　　【關(guān)鍵詞】  結(jié)核分枝桿菌；熱休克蛋白65；人粒巨噬細(xì)胞集落刺激因子；雙順反子；基因佐劑

　　0引言

　　卡介苗（bacille calmetteguerin， BCG）是已被廣泛應(yīng)用于預(yù)防結(jié)核?。╰uberculosis， TB）的減毒活疫苗。 由于結(jié)核DNA疫苗的制備簡便、免疫效果好，目前已經(jīng)成為TB的熱門侯選疫苗之一［1］。 結(jié)核桿菌熱休克蛋白65KD基因（heat shock protein 65KD， Hsp65）是研究最早的結(jié)核抗原之一，可以在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)結(jié)核分枝桿菌的感染產(chǎn)生強(qiáng)烈的保護(hù)性免疫反應(yīng)［2］。粒細(xì)胞吞噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocytemacrophage  colonystimulating factor， GMCSF）作為良好的基因佐劑，可以利用其上調(diào)機(jī)體免疫水平的作用增強(qiáng)DNA疫苗的效能［3-4］。 雖然Hsp65抗原和GMCSF分別在感染免疫中的作用已經(jīng)被研究證實(shí)有效，但對(duì)人GMCSF協(xié)同Hsp65抗原在結(jié)核桿菌感染中的免疫應(yīng)答特點(diǎn)和保護(hù)力尚不清楚［5］。 我們將兩者同時(shí)克隆到同一載體上，構(gòu)建含結(jié)核桿菌Hsp65和基因佐劑hGMCSF的雙順反子真核質(zhì)粒，旨在為進(jìn)一步了解結(jié)核DNA疫苗的免疫效果奠定基礎(chǔ)。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　結(jié)核分枝桿菌H37Rv株基因組，大腸桿菌DH5α，載體pIRES和質(zhì)粒pORFhGMCSF（暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室提供）；Ex Taq DNA聚合酶，T4 DNA連接酶，限制性內(nèi)切酶Nhe I，EcoR I， Xba I和Not I，DL1 kb marker，質(zhì)粒提取試劑盒，DNA凝膠回收純化試劑盒（大連寶生物公司）；兩對(duì)PCR引物、重組質(zhì)粒上目的基因的序列測定由上海生工生物工程公司完成； Transmaster轉(zhuǎn)染試劑（廣州博理生物科技公司）；即用型免疫組化Biotin SPHRP試劑盒，DAB酶底物顯色試劑盒（北京鼎國生物科技公司）；鼠抗人Hsp65蛋白單克隆抗體和人hGMCSF蛋白ELISA檢測試劑盒（深圳市晶美生物科技公司）。

　　1.2方法

　　1.2.1目的基因

　　Hsp65和hGMCSF的PCR擴(kuò)增參照GenBank上結(jié)核分枝桿菌H37Rv株Hsp65基因CDS序列（NCBI登陸號(hào)：M15467）分別設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

　　1.2.2pIHsp65真核載體的構(gòu)建與鑒定

　　將Hsp65的PCR產(chǎn)物經(jīng)過回收純化后與載體pIRES，同時(shí)用Nhe I和EcoR I雙酶切，酶切后進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，并經(jīng)過凝膠回收純化試劑盒回收酶切產(chǎn)物，將兩者酶切純化的產(chǎn)物按照3∶1的摩爾比混合，用T4 DNA連接酶連接24 h.轉(zhuǎn)化用低溫CaCl2制備的E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)菌，然后涂布于含氨芐青霉素50 μg/mL的LB固體培養(yǎng)基中。次日，隨機(jī)挑取10個(gè)單菌落，分別接種于3 mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃下150 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。先取少量菌液煮沸作為模板進(jìn)行菌落PCR檢測是否有Hsp65的存在，將菌落PCR篩選呈陽性的菌落用質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒DNA.將提取的質(zhì)粒DNA用Nhe I和EcoR I雙酶切，進(jìn)行電泳檢測，以DL1 kb  marker為分子量參照， 將篩選出的陽性克隆產(chǎn)物的菌液進(jìn)行測序鑒定。 測序采用Sanger雙脫氧鏈終止法， 對(duì)插入序列的兩端進(jìn)行測定， 測序工作由上海生物工程公司完成。

　　1.2.3pIHsp65GM真核表達(dá)

　　質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定同構(gòu)建pIHsp65載體方法一樣，將hGMCSF的PCR產(chǎn)物經(jīng)過回收純化后與載體pIHsp65同時(shí)用Xba I 和Not I 雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收純化后，將兩者酶切純化的產(chǎn)物按照3∶1的摩爾比混合，用T4 DNA連接酶連接24 h，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌E.coli DH5α，涂布于含氨芐青霉素50 μg/mL的LB固體培養(yǎng)基中。次日，隨機(jī)挑取10個(gè)單菌落，分別接種于3 mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃下150 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。將菌落PCR篩選呈陽性的菌落用質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒DNA.將提取的質(zhì)粒DNA用Xba I 和Not I雙酶切，進(jìn)行電泳檢測，以DL1 kb marker為分子量參照，將篩選出的陽性克隆產(chǎn)物的菌液進(jìn)行測序鑒定。

　　1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染

　　取對(duì)數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞接種在12孔板內(nèi)， 待細(xì)胞生長至70%～80 %時(shí)， 加入陽離子多聚體轉(zhuǎn)染試劑Transmaster和質(zhì)粒pIHsp65GM的混合物。饑餓培養(yǎng)1 h，加入含100 mL/L小牛血清的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，檢測Hsp65和hGMCSF蛋白的表達(dá)。

　　1.2.5Hsp65蛋白表達(dá)的免疫組化檢測

　　采用未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為空白對(duì)照和轉(zhuǎn)染了空質(zhì)粒pIRES的細(xì)胞為陰性對(duì)照，將空質(zhì)粒pIRES和重組質(zhì)粒pIHsp65GM轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞48 h，去除培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖鹽水PBS沖洗。經(jīng)40 g/L的多聚甲醛固定后，依次滴加過氧化酶阻斷劑，正常動(dòng)物非免疫血清，1∶1000鼠抗人Hsp65蛋白抗體，生物素標(biāo)記二抗和鏈霉素抗生物素蛋白。最后加入新鮮配制的DAB工作液染色，顯微鏡下觀察結(jié)果，Hsp65蛋白的表達(dá)以細(xì)胞質(zhì)染呈棕黃色者為陽性。

　　1.2.6ELISA法檢測

　　hGMCSF蛋白表達(dá)水平分別收集pIRES和質(zhì)粒pIHsp65GM轉(zhuǎn)染24 h和48 h的HepG2細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)的上清液，采用ELISA雙抗體夾心法檢測hGMCSF蛋白的表達(dá)量，按照試劑盒說明進(jìn)行操作。用酶標(biāo)儀在吸光度A450 nm下測定樣品和試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品的A值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品所測A值繪制的蛋白濃度與A值相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品中hGMCSF蛋白的含量（以空白孔調(diào)零）。

　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行分析，組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　2結(jié)果

　　2.1Hsp65和hGMCSF基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析

　　瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，PCR產(chǎn)物分別為1.64 kb和0.47 kb的特異性片段，與預(yù)期Hsp65和hGMCSF基因大小相符（圖1）。

　　2.2重組質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶消化鑒定

　　質(zhì)粒pIHsp65經(jīng)Nhe I和EcoR I雙酶切后，電泳可見大小約6.1 kb與1.64 kb兩片段，與載體pIRES經(jīng)Nhe I和EcoR I雙酶切產(chǎn)物和Hsp65基因PCR產(chǎn)物的2條特異性條帶對(duì)比，大小相符（圖2A）。重組質(zhì)粒pIHsp65GM經(jīng)Xba I 和Not I雙酶切后，電泳可見大小約為7.74 kb與0.47 kb兩片段，與質(zhì)粒pIHsp65經(jīng)Xba I和Not I雙酶切產(chǎn)物和hGMCSF基因PCR產(chǎn)物的2條特異性條帶對(duì)比，大小相符（圖2B）。

　　2.3序列分析鑒定

　　對(duì)質(zhì)粒pIHsp65上的多克隆位點(diǎn)A（multiple cloning sites A，MCSA）內(nèi)的DNA序列進(jìn)行序列分析鑒定，結(jié)果與結(jié)核分支桿菌H37Rv株的Hsp 65的基因序列完全相同。對(duì)質(zhì)粒pIHsp65GM上的多克隆位點(diǎn)B（multiple cloning sites B， MCSB）內(nèi)的DNA序列進(jìn)行序列分析鑒定， 結(jié)果與hGMCSF的基因序列完全相同。

　　2.4Hsp65蛋白在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)

　　顯微鏡下觀察，與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的空白對(duì)照和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pIRES細(xì)胞的陰性對(duì)照對(duì)比，pIHsp65GM轉(zhuǎn)染的部分HepG2細(xì)胞中胞質(zhì)染呈棕黃色，表明Hsp65表達(dá)呈陽性（圖3）。

　　2.5ELISA檢測

　　pIRES對(duì)照組在轉(zhuǎn)染24和48 h時(shí)細(xì)胞上清液hGMCSF的表達(dá)量分別為（1.371±0.083） pg/mL和（1.782 ±0.127） pg/mL （n=3），而pIHsp65GM在轉(zhuǎn)染24和48 h時(shí)細(xì)胞上清液hGMCSF的表達(dá)量分別為（271.103 ±4.731） pg/mL和（253.124±3.943）pg/mL；pIHsp65GM轉(zhuǎn)染組在轉(zhuǎn)染24和48 h時(shí)hGMCSF的表達(dá)量與pIRES對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

　　3討論

　　近年來，對(duì)結(jié)核研究最多的抗原主要有Hsp65，Ag85B， ESAT6和MPT64等［6-7］。其中Hsp65具有免疫優(yōu)勢抗原的特性，能誘導(dǎo)和增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫的發(fā)生，并可激活γδT細(xì)胞，分泌高水平的IFNγ和殺傷感染的細(xì)胞，是人體感染結(jié)核桿菌以后免疫系統(tǒng)的主要靶抗原，是T細(xì)胞攻擊的主要對(duì)象［8］。 由于僅含有單抗原基因的DNA疫苗并不足以引發(fā)良好的免疫效果，還需要結(jié)合其他的手段如基因佐劑，特別是將細(xì)胞因子與DNA疫苗共表達(dá)才能產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫保護(hù)力。 GMCSF作為DNA疫苗的免疫佐劑，能夠調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞的分化和成熟，以及MHC和共刺激分子的表達(dá)水平，并且通過調(diào)節(jié)抗原提呈細(xì)胞尤其是樹突狀細(xì)胞的數(shù)量和功能來調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的強(qiáng)度。有研究認(rèn)為將GMCSF作為佐劑與基因疫苗共同免疫小鼠結(jié)果比單獨(dú)應(yīng)用基因疫苗產(chǎn)生更強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答并可提供更強(qiáng)的免疫保護(hù)力［3-5］。本實(shí)驗(yàn)采用載體pIRES為雙順反子真核表達(dá)質(zhì)粒，在上下游克隆位點(diǎn)之間的序列為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)， 此段序列在轉(zhuǎn)錄后能夠自動(dòng)斷裂， 使上下游克隆位點(diǎn)插入的基因能夠獨(dú)立高效的表達(dá)，從而避免了融合表達(dá)蛋白活性低下問題， 為兩種蛋白表達(dá)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和結(jié)核疫苗研制提供較大方便。

　　與以往結(jié)核DNA疫苗的研究比較，本實(shí)驗(yàn)具有以下特點(diǎn)：①實(shí)現(xiàn)了目的基因與細(xì)胞因子基因在同一載體上共同表達(dá)。如果將DNA疫苗與編碼GMCSF的質(zhì)粒混合注射會(huì)對(duì)DNA疫苗的免疫效果產(chǎn)生干擾作用；若將GMCSF與目的基因共同克隆到一個(gè)載體中，由于兩個(gè)基因具有相同的局部微環(huán)境，往往可以獲得較好的免疫效果［9］。②本研究使用雙順反子真核表達(dá)載體pIRES，將兩個(gè)基因分別克隆到兩個(gè)多克隆位點(diǎn)，兩者各自表達(dá)，不相互影響蛋白表達(dá)的空間結(jié)構(gòu)。因?yàn)楸磉_(dá)為融合產(chǎn)物的DNA疫苗可能破壞抗原的三維結(jié)構(gòu)，對(duì)抗體的生成產(chǎn)生負(fù)面影響［10］。

　　【參考文獻(xiàn)】［1］Mustafa AS. Development of new vaccines and diagnostic reagents against tuberculosis ［J］。 Mol Immunol， 2002，39：113-119.

　?。?］Baek KM， Ko SY， Lee M， et al. Comparative analysis of effects of cytokine gene adjuvants on DNA vaccination against mycobacterium tuberculosis heat shock protein 65［J］。 Vaccine， 2003，21（2526）：3684-3689.

　　［3］Zhang XZ， Maziar D， Patricia N， et al. Intramuscular immunization with a monogenic plasmid DNA tuberculosis vaccine： Enhanced immunogenicity by electroporation and coexpression of GMCSF transgene［J］。 Vaccine，2007，25（7）： 1342-1352.

　?。?］Qiu JT， Chang TC， Lin CT， et al. Novel codon optimized GMCSF gene as an adjuvant to enhance the immunity of a DNA vaccine against HIV1 Gag［J］。 Vaccine， 2007，25（2）： 253-263.

　　［5］Hongxun S， Vladimir MP， Corey M， et al. Regional， but not systemic recruitment/ expansion of dendritic cells by a pluronicformulated Flt3ligand plasmid with vaccine adjuvant activity［J］。 Vaccine， 2003，21（26）：3019-3020.

　?。?］師長宏，范雄林，柏銀蘭，等。 結(jié)核分枝桿菌Ag85BESAT6融合蛋白在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答及其保護(hù)力［J］。第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，25（18）：1633- 1636.

　?。?］師長宏，安家澤，唐小鳳，等。 結(jié)核分枝桿菌MPT64ESAT6融合蛋白在小鼠內(nèi)誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答及其保護(hù)力［J］。第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，27（9）：769-771.

　　［8］Lima KM， Santos SA， Lima AM， et al. Single dose of a vaccine based on DNA encoding mycobacterial hsp65 protein plus TDMloaded PLGA microspheres protects mice against a virulent strain of mycobacterium tuberculosis［J］。 Gene Ther，2003，10（8）：678-685.

　?。?］李忠明。當(dāng)代新疫苗 ［M］。北京：高等教育出版社，2001：163-164.

　　［10］Hildegund CJE. DNA Vaccine ［M］。Translated by Li QH， Liu LD， Che YC， Beijing： Chemistry Industry Press，2005：387-389.