【摘要】  目的：觀察聚己內(nèi)酯（PCL）電紡纖維支架材料對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞（BMSCs）增殖及分化特點(diǎn)的影響，評(píng)價(jià)其作為骨組織工程的支架材料的應(yīng)用前景。 方法： 將兔BMSCs與PCL電紡纖維支架材料在培養(yǎng)板內(nèi)共培養(yǎng)。 采用形態(tài)學(xué)觀察、MTT法及ALP檢測等方法檢測BMSCs在PCL電紡纖維表面的粘附、增殖和分化能力。 結(jié)果： 體外培養(yǎng)的BMSCs能在PCL電紡纖維表面正常粘附和增殖，并且表達(dá)較高的堿性磷酸酶活性。 結(jié)論： PCL電紡纖維適合作為支架材料應(yīng)用于BMSCs為種子細(xì)胞的組織構(gòu)建。

　　【關(guān)鍵詞】  電紡纖維；聚己內(nèi)酯；骨髓基質(zhì)細(xì)胞

　　0引言

　　理想的組織工程支架材料要求其不但能夠作為種子細(xì)胞體內(nèi)擴(kuò)增和增殖的支架，而且應(yīng)當(dāng)能夠成為生長因子、生物活性物質(zhì)和基因的生物載體，發(fā)揮細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的作用［1］。 目前已有近百種聚合物成功的通過這一技術(shù)獲取了超細(xì)纖維并被陸續(xù)應(yīng)用于膜技術(shù)、增強(qiáng)材料、紡織品、光學(xué)傳感器、醫(yī)藥釋放體系以及組織工程支架材料制備等諸多領(lǐng)域 ［2］。 本研究旨在通過聚己內(nèi)酯（polycaprolactone， PCL）電紡纖維支架材料對(duì)兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞（bone marrow stromal cells， BMSCs）生長、增殖和功能分化作用的研究，初步探討PCL電紡纖維作為組織工程支架材料的應(yīng)用前景。

　　1材料和方法

　　1.1材料聚己內(nèi)酯（PCL，美國Sigma公司，Mn=80000）；二甲基甲酰胺（DMF，西安化學(xué)試劑公司）；氯仿（西安化學(xué)試劑公司）；BGG40/2高壓直流電源（北京機(jī)電研究所，030KV）；JSM6700F型掃描電鏡（日本JEOL公司）；BX60型熒光顯微鏡（日本 Olympus公司）；酶聯(lián)免疫檢測儀（美國BioTek公司）；1.5 mo齡新西蘭幼兔1只，雄性，體質(zhì)量1.5 kg （第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）；DMEM培養(yǎng)液（美國Gibco BRL公司）；胎牛血清（浙江金華清湖犢牛利用研究所）；胰蛋白酶（上海浦東生化試劑廠）；MTT（美國Sigma公司）；PholloidinFITC（美國Sigma公司）；堿性磷酸酶（alkaline Phosphatase，ALP）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

　　1.2方法

　　1.2.1PCL電紡纖維支架的制備以氯仿/DMF（體積比2∶1）的混合溶液為溶劑，配制濃度為80 g/L的PCL電紡絲溶液。 將電紡絲溶液加入一個(gè)安裝有8號(hào)不銹鋼注射針頭的自制玻璃加樣管。 針頭即噴絲口與BGG40/2高壓直流電源的正極相連，針頭下方安裝一個(gè)接地的銅板，上覆鋁箔作為纖維的接收屏與高壓直流電源的負(fù)極相連。 在外加電壓10 kV，接收距離12 cm，電紡絲溶液流量為3 mL/h的條件下進(jìn)行靜電紡絲。 收集接收屏表面獲得的縱橫交錯(cuò)的無紡纖維氈，置于干燥器中干燥保存。

　　1.2.2兔BMSCs的原代培養(yǎng)與接種取新西蘭幼兔四肢長骨，縱行剖開，DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，靜置后取上清進(jìn)行培養(yǎng)BMSCs. 24 h后換液，去除未貼壁的血細(xì)胞。 每3 d換液1次，2.5 g/L胰酶常規(guī)消化傳代，倒置顯微鏡下觀察。 取第二代生長良好的BMSCs，胰酶消化傳代。 實(shí)驗(yàn)分組為PCL電紡纖維實(shí)驗(yàn)組和細(xì)胞培養(yǎng)板對(duì)照組兩組。 將傳代培養(yǎng)的第二代BMSCs以4×104/cm2濃度接種于各組，每孔加入500 μL接種細(xì)胞液，置入細(xì)胞培養(yǎng)箱4 h，再加入500 μL培養(yǎng)液，50 mL/L CO2， 飽和濕度、37℃繼續(xù)培養(yǎng)。

　　1.2.3肌動(dòng)蛋白actin直接免疫熒光染色培養(yǎng)8 h后取出PCL電紡纖維試件，PBS沖洗3遍。 37 mL/L甲醛的PBS溶液固定5 min， PBS洗滌2遍。 丙酮脫水，1 mL/L TritonX100滲透5 min. 10 mg/L PholloidinFITC 37℃孵育染色40 min，抗熒光淬滅液封片。 于365 nm熒光顯微鏡下觀察記錄。

　　1.2.4掃描電鏡觀察于培養(yǎng)3 d后取出PCL電紡纖維試件，PBS沖洗3遍，25 mL/L戊二醛固定24 h. 乙腈梯度脫水，10 g/L鋨酸處理1 h，臨界點(diǎn)干燥，離子濺射儀噴金。 導(dǎo)電膠固定，以冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察，電子加速率為5 kV.

　　1.2.5MTT檢測于培養(yǎng)1，3，5，7 d后向?qū)嶒?yàn)各組分別加入2.5 g/L胰蛋白酶消化3 min，然后加入含100 mL/L胎牛血清的DMEM終止消化。 500 g離心10 min，每管重新加入DMEM培養(yǎng)液200 μL，接種至96孔培養(yǎng)板。 每組4孔，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL，37℃孵育4 h. 在酶聯(lián)免疫檢測儀上測各孔A490 nm值，每組3個(gè)試件。

　　1.2.6ALP活性檢測培養(yǎng)的第3，7， 14日后，向?qū)嶒?yàn)各組分別加入2.5 g/L胰蛋白酶消化3 min，然后加入含100 mL/L胎牛血清的DMEM終止消化。 將每個(gè)樣本的細(xì)胞懸液加入離心管，500 g離心10 min. 每管加入200 μL細(xì)胞裂解液，充分吹打混合。 轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板，加入0.1 mL/L Triton X100 50 μL，4℃過夜。 采用ALP檢測試劑盒，每孔加入ALP反應(yīng)底物100 μL，37℃孵育30 min. 0.2 mol/L NaOH 50 μL終止反應(yīng)，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測各孔A410 nm值，每組3個(gè)試件。

　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)以x±s表示，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 10.0進(jìn)行方差分析。

　　2結(jié)果

　　2.1形態(tài)學(xué)觀察接種8 h后BMSCs在PCL電紡纖維材料表面的actin直接免疫熒光染色， BMSCs細(xì)胞以梭形和長方形為主，邊緣有弧度，胞質(zhì)豐滿、偽足伸展充分。 細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)含大量束狀排列的微絲結(jié)構(gòu)，向兩端伸展，排列有序。 核周圍染色加深，呈圓形或卵圓形的細(xì)胞核（圖1）。 掃描電鏡下示BMSCs伸展更加充分，生長連接成片。 BMSCs下可見PCL電紡纖維呈相互交聯(lián)的多孔網(wǎng)狀無紡結(jié)構(gòu)，纖維交錯(cuò)相疊、光滑均一、結(jié)構(gòu)疏松、孔隙結(jié)構(gòu)密集，纖維直徑在153～612 nm之間（圖2）。

　　2.2MTT檢測經(jīng)方差分析，PCL電紡纖維實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的A490 nm值均隨共培養(yǎng)時(shí)間的增加而增大（表1），7 d>5 d>3 d>1 d，各檢測時(shí)間點(diǎn)之間有顯著性差異（P<0.05）；而在1，3，5，7 d各檢測時(shí)間點(diǎn)，兩組吸光度之間無顯著差異（P>0.05）。表1聚己內(nèi)酯電紡纖維支架對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖的影響（略）

　　2.3ALP活性檢測經(jīng)方差分析，PCL電紡纖維實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的吸光度A值均隨共培養(yǎng)時(shí)間的增加而增大（表2），14 d>7 d>3 d，各檢測時(shí)間點(diǎn)之間有顯著性差異（P<0.05）；而在3，7，14 d各檢測時(shí)間點(diǎn)，兩組吸光度之間無顯著差異（P>0.05）。表2聚己內(nèi)酯電紡纖維支架對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞ALP活性的影響（略）

　　3討論

　　種子細(xì)胞與支架材料是組織工程研究的兩個(gè)核心問題。 骨髓來源的BMSCs具有多向轉(zhuǎn)化的潛能，通過生長因子的誘導(dǎo)，可以分化為成骨細(xì)胞，在骨組織的修復(fù)、改建以及愈合過程中發(fā)揮重要的作用，是目前最為合適的骨組織工程種子細(xì)胞［3］。 PCL是由ε己內(nèi)酯開環(huán)聚合所得到的線性脂肪族聚酯，具有良好的熱穩(wěn)定性、生物降解性、力學(xué)性能、藥物通過性以及生物相容性。 其降解產(chǎn)物對(duì)人體無毒，目前也廣泛的應(yīng)用于骨折固定材料、手術(shù)縫線、醫(yī)用敷料、藥物控釋和組織工程支架材料等領(lǐng)域［4-5］。 利用靜電紡絲技術(shù)制備組織工程支架材料的優(yōu)勢在于：能夠制備出比表面積大、孔徑小、孔隙率高、纖維均一性好，直徑與細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)膠原纖維相近的連續(xù)超細(xì)纖維（50～500 nm），從而最大程度的模仿細(xì)胞外基質(zhì)天然結(jié)構(gòu)；制備方法簡單快捷，支架材料可以是單一的聚合物，也可以是多種聚合物的復(fù)合體，并可以在支架中引人無機(jī)粒子（如羥基磷灰石等）、生長因子甚至活細(xì)胞等； 通過選擇適當(dāng)?shù)牟牧虾图庸?shù)，能夠調(diào)控支架材料的孔隙率、厚度、三維結(jié)構(gòu)、降解率和力學(xué)性能；利用同軸電紡技術(shù)還能夠?qū)⑸锘钚苑肿蛹尤氲骄酆衔镏Ъ苤?，?shí)現(xiàn)有效釋放［5-7］。

　　實(shí)驗(yàn)中所制備的PCL電紡纖維大體外觀光滑均一，纖維直徑為153～612 nm，為納米級(jí)多孔無紡纖維。 其相互交錯(cuò)的多孔結(jié)構(gòu)與天然細(xì)胞外基質(zhì)的膠原纖維結(jié)構(gòu)近似，有利于細(xì)胞的粘附、鋪展和增殖。 細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白actin 的結(jié)構(gòu)在維持細(xì)胞形狀及附著方面起著非常重要的作用，actin染色通常用來研究細(xì)胞在材料表面的移動(dòng)、伸展及形態(tài)。 Actin直接免疫熒光染色結(jié)果顯示BMSCs能夠在PCL電紡纖維表面形成早期附著。 掃描電鏡觀察進(jìn)一步表明生長在PCL電紡纖維材料表面的BMSCs不但可以早期貼附與材料表面，并且能夠在短時(shí)間內(nèi)形成良好的鋪展形態(tài)。 MTT比色法試驗(yàn)?zāi)軌驒z測細(xì)胞存活和生長。 我們的結(jié)果表明BMSCs能夠在PCL電紡纖維表面正常的存活和增殖，并且同對(duì)照組一樣具有較旺盛的增殖能力，生物相容性良好。 ALP是成骨細(xì)胞分化和功能成熟的早期標(biāo)志，在成骨細(xì)胞趨向成熟的轉(zhuǎn)化限制點(diǎn)扮演重要角色。 測定成骨細(xì)胞內(nèi)ALP活性的變化可以了解成骨細(xì)胞的分化成熟程度以及細(xì)胞成骨礦化的能力。 我們的結(jié)果表明隨著時(shí)間的增加PCL電紡纖維表面的BMSCs同對(duì)照組一樣，持續(xù)的保持著成熟分化功能，表達(dá)出完善的成骨活性。

　　【參考文獻(xiàn)】［1］Rohner U， Hutmacher DW， See Y， et al. Individually CADCAM technique designed， bioresorbable 3dimensional polycaprolactone framework for experimental reconstruction of craniofacial defects in the pig［J］。 Mund Kiefer Gesiclitschir， 2002， 6（3）： 162-167.

　　［2］Li D， Xia YN. Electrospinning of nanofibers： reinventing the wheel？［J］。 Adv Mater， 2004， 16（14）： 1170-1252.

　　［3］Burg KJ， Porter S， Kellam JF. Biomaterial developments for bone tissue engineering ［J］。 Biomaterials， 2000， 21（23）： 2347-2359.

　　［4］Aerturas MR， Molpeceres J， Guzmam M， et al. Development of a new cyclosporine formation based on poly（caprolactone） microspheres［J］。J Microencapsul，2002，19（19）：61-72.

　?。?］李冀， 張育敏， 王志強(qiáng)。 骨組織工程支架材料合成技術(shù)的進(jìn)展［J］。 中華創(chuàng)傷骨科雜志，2006，8（8）：773-776.

　?。?］何創(chuàng)龍， 黃爭鳴， 張彥中， 等。 靜電紡絲法制備組織工程納/微米纖維支架［J］。自然科學(xué)進(jìn)展， 2005，15（10）：1175-1182.

　?。?］Reneker DH， Chum I. Nanometre diameter fibers of polymer produced by electrospinning［J］。 Nanotechnology， 1996，7（3）：216-223.