【摘要】  目的 觀察五氯酚鈉對小鼠細(xì)胞免疫、體液免疫和巨噬細(xì)胞功能的毒性作用。方法 將五氯酚鈉以25，50和100 mg/kg經(jīng)灌胃方式一次給予小鼠，然后觀察給藥后3，24和48 h小鼠各項免疫功能的變化，采用T淋巴細(xì)胞增殖法測定細(xì)胞免疫功能，采用B淋巴細(xì)胞增殖法測定體液免疫功能，采用巨噬細(xì)胞吞噬能力和分泌NO的能力來測定巨噬細(xì)胞功能。結(jié)果 100 mg/kg五氯酚鈉染毒后3 h，小鼠的脾臟和胸腺相對重量較對照組降低，脾臟B淋巴細(xì)胞的增殖能力受到抑制，腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能和NO生成能力受到抑制。25和50 mg/kg五氯酚鈉在染毒后24 h依然對脾細(xì)胞中B淋巴細(xì)胞增殖能力產(chǎn)生抑制作用。這種抑制效應(yīng)到48 h時完全消失。結(jié)論 五氯酚鈉一次染毒在25～100 mg/kg劑量范圍內(nèi)對小鼠體液免疫和細(xì)胞免疫功能產(chǎn)生抑制作用，100 mg/kg對巨噬細(xì)胞功能產(chǎn)生抑制作用，對細(xì)胞免疫功能未見影響。

　　【關(guān)鍵詞】  五氯酚鈉

　　五氯酚鈉（又稱滅釘螺藥，PCP-Na）是在世界范圍被廣泛使用的一種農(nóng)藥，由于大面積推廣，引起了一定的環(huán)境污染，對人類健康造成影響〔1，2〕。Lang等〔3〕利用人淋巴細(xì)胞在體外接觸五氯酚研究中發(fā)現(xiàn)，無論工業(yè)品還是分析純五氯酚在10～40μmol/L濃度下與淋巴細(xì)胞共同孵育8d，對于IgG和IgM抗體的產(chǎn)生量均有明顯的抑制作用。Daniel等〔4〕在人群研究中發(fā)現(xiàn)，血液中五氯酚濃度的升高能夠?qū)е耇細(xì)胞功能障礙。體外研究表明，5mg/L以上的五氯酚能夠抑制克鯉魚和港灣魚的巨噬細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞殺菌活性〔5〕。目前的研究基本上以五氯酚為主，盡管五氯酚鈉與五氯酚的代謝途徑類似，但其毒性表現(xiàn)是否一致仍需要進(jìn)一步探索。本研究采用五氯酚鈉一次性染毒小鼠，觀察染毒后不同時間小鼠免疫功能的變化。

　　1  材料與方法

　　11  實驗動物  清潔級ICR雌性小鼠150只（北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗運動科學(xué)部）；體重20～24g，雌性，動物合格證號：SCXK（京）2002-0001.動物飼養(yǎng)室溫，20～25℃，動物進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)飼料，自由飲用自來水。

　　12  主要試劑  五氯酚鈉（國產(chǎn)，分析純，sodium pentachlorophenate）；四甲基偶氮噻唑藍(lán)（MTT），刀豆蛋白A（ConA），脂多糖（LPS，美國Sigma公司）；RPMI1640完全培養(yǎng)液，Hanks液等。

　　13  動物染毒和處理  將小鼠隨機(jī)分為4組，每組5只。分別為對照組（蒸餾水），25，50和100mg/kg組。將五氯酚鈉一次性以灌胃方式染毒，分別在小鼠染毒后3，24和48h，處死小鼠，取出臟器，剔除結(jié)締組織和脂肪，吸凈殘留血液，稱重，進(jìn)行各項指標(biāo)測定。

　　14  T淋巴細(xì)胞增殖  處死小鼠，無菌取脾，制備成單個細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞數(shù)調(diào)整至2×106個/ml.將每份細(xì)胞懸液分2孔加入24孔板，每孔1ml，其中一孔作為對照，另一孔加入20μl ConA（400μg/ml）做為刺激孔，將細(xì)胞放入5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中孵育68h，取出加入MTT（5mg/kg）50μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清，每孔加入1ml酸性異丙醇，吹打均勻，在酶標(biāo)儀上570nm波長下比色。

　　15  淋巴細(xì)胞增殖  方法同T淋巴細(xì)胞增值，所用刺激物為25μl LPS（400μg/ml）。

　　16  巨噬細(xì)胞吞噬功能  處死小鼠后將RPMI 1640完全培養(yǎng)液2ml，注入小鼠腹腔，收集灌洗的液體，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至５×１０４個/ml，將細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板，每孔100μl.將巨噬細(xì)胞置入5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中孵育2h，取出后棄上清，加入用RPMI 1640完全培養(yǎng)液稀釋的中性紅（50μg/ml）100μl，再置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中孵育30min，取出96孔板，棄上清，每孔加入150μl沖洗液，沖洗后棄去。再加入100μl溶解液，在721分光光度計上540nm波長下比色。

　　17  巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO測定  巨細(xì)胞收集同巨噬細(xì)胞吞噬功能測定，收集細(xì)胞后，將細(xì)胞調(diào)整至１×１０６個/ml，加入24孔培養(yǎng)板，每孔1ml，放入5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中孵育2h，取出后棄上清，每孔重新加入1ml RPMI 1640完全培養(yǎng)液，同時加入LPS（終濃度5μg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集培養(yǎng)上清，用1ml培養(yǎng)上清與1ml Greiss試劑混勻，于540nm波長下比色。同時用亞硝酸鈉配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算培養(yǎng)上清中亞硝酸鹽氮含量。

　　18  統(tǒng)計分析  采用SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析。

　　2  結(jié)果

　　21  一般狀況

　　211  不同劑量的五氯酚鈉一次染毒3 h對小鼠器官變化的影響（表1）  一次染毒3 h后，100 mg/kg五氯酚鈉劑量組小鼠的脾臟和胸腺相對重量明顯降低，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而肝臟和腎臟相對重量與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。50和25 mg/kg五氯酚鈉劑量組小鼠脾臟、胸腺、腎臟和肝臟的相對重量與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

　　表1  不同劑量組染毒3 h后小鼠器官重量變化（略）

　　注：相對重=臟器濕重（mg）/體重（g）；與對照組比較*P＜005；n=5

　　212  不同劑量染毒24h后小鼠器官變化25，50和100mg/kg五氯酚鈉一次給予小鼠24h后，小鼠的脾臟、胸腺、肝臟和腎臟的相對重要與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

　　22  五氯酚鈉毒對小鼠免疫功能的影響

　　221  五氯酚鈉對小鼠T淋巴細(xì)胞增殖的影響  25，50和100mg/kg五氯酚鈉染毒小鼠3，24和48h后，小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖能力均未受到影響。

　　222  五氯酚鈉對小鼠B淋巴細(xì)胞增殖的影響（表2）  25mg/kg劑量組染毒3h后，小鼠B淋巴細(xì)胞增殖能力受到抑制，抑制率為46%，隨著時間延長，染毒后24和48h時這種抑制效應(yīng)消失。50mg/kg劑量組染毒3h，也可見小鼠B淋巴細(xì)胞增殖能力受到抑制，抑制率為46%，隨著時間延長，至染毒后24h，這種抑制效應(yīng)依然存在，抑制程度減弱，抑制率為35%，進(jìn)一步觀察染毒后48h這種抑制效應(yīng)消失。100mg/kg劑量組染毒3和24h，小鼠B淋巴細(xì)胞的增殖能力均受到抑制，抑制率分別為38%和40%，隨著時間延長到染毒后48h，抑制效應(yīng)消失。

　　表2  不同染毒劑量對小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞增殖的影響（略）

　　注：與對照組比較*P＜005，**P＜001；n=5

　　223  五氯酚對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響（表3）  本研究發(fā)現(xiàn)，不同劑量五氯酚鈉染毒組在3，24和48h時間點，只有100mg/kg組染毒3h后，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能受到抑制，而其他時間點和劑量均未見小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞功能受到抑制。

　　224  巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響（表4）  由試驗結(jié)果可見，在染毒所用的3個劑量中，只有100mg/kg五氯酚鈉在給藥3h后抑制了巨噬細(xì)胞分泌NO的能力，使得培養(yǎng)液中亞硝酸鹽氮含量減少，其他時間點和劑量均未觀察到巨噬細(xì)胞生成NO的能力受損。

　　表3  五氯酚鈉對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響（略）

　　注：與對照組比較，** P＜001；n=5

　　表4  五氯酚鈉對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌NO的影響（略）

　　注：與對照組比較，* P＜005；n=5

　　3  討論

　　1000mg/kg五氯酚鈉一次給小鼠3h后，脾臟和胸腺重量明顯降低，小鼠的B淋巴細(xì)胞增殖和巨噬細(xì)胞吞噬及巨噬細(xì)胞分泌NO均受到抑制，表明五氯酚鈉對免疫系統(tǒng)有抑制作用。而T淋巴細(xì)胞增殖未受影響，提示五氯酚鈉對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生有害作用時，有一定的選擇性。五氯酚鈉給藥3h后，巨噬細(xì)胞100mg/kg組出現(xiàn)功能抑制，而脾臟B淋巴細(xì)胞增殖有25和50mg/kg就出現(xiàn)抑制，表明B淋巴細(xì)胞對五氯酚鈉毒性敏感。五氯酚在哺乳動物細(xì)胞色素P450微料體混合功能氧化酶參與代謝，轉(zhuǎn)化形成四氯氫醌（TCHQ）和四氯兒茶酚（Ｃ１４ＣＡＴ）〔6-8〕。四氯氫醌對免疫細(xì)胞有損傷作用，但是五氯酚在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成四氯氫醌需要一定的時間。五氯酚（PC）在肝組織中經(jīng)過代謝，產(chǎn)生的未結(jié)合四氯氫醌于攝入PCP后4h達(dá)到高峰，其后下降排出〔１１〕，則達(dá)到臟器（脾臟，腹腔）的時間必然還要延遲。給予B6C3F雄性小鼠300mg/（kg.d）的四氯氫醌2周后肝細(xì)胞核DNA的8OHdG比對照組明顯增多，但是一次注射20或者50mg/kg的四氯氫在6和24h均未發(fā)現(xiàn)8OHdG的含量增加〔9〕，提示四氯氫醌在體內(nèi)的作用需較長時間。因此，在本研究中，染毒3h后觀察到的免疫細(xì)胞功能的變化，可能是五氯酚鈉本身的直接作用。

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