【摘要】  目的：探討鈥激光（Ho：YAG laser）對(duì)腎腫瘤的毀損效應(yīng)。 方法：制作兔的腎VX2腫瘤模型，在手術(shù)直視下采用不同鈥激光功率對(duì)腫瘤組織進(jìn)行徹底照射。 觀察照射后腫瘤組織及周邊腎臟組織的病理變化，另外每組各5只于照射2 wk后處死，比較腫瘤的生長(zhǎng)情況。 結(jié)果：鈥激光照射后立即行HE染色可發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凝固性壞死，損毀灶大小隨鈥激光的照射參數(shù)增大而增大，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，所有5只照射組動(dòng)物的腫瘤原發(fā)灶均被完全破壞，而對(duì)照組的腫瘤平均體積為（2645.5±174.2） mm3. 結(jié)論： 鈥激光對(duì)兔的腎VX2腫瘤組織有明顯殺傷作用，且有較好的可控性和操作性。

　　【關(guān)鍵詞】  鈥激光

　　0.引言

　　鈥激光是由摻鈥的釔鋁石榴石激光器（Ho：YAG）產(chǎn)生的中紅外激光，因其具有良好的物理特性及生物學(xué)效應(yīng)，目前已在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用［1-5］，然而尚無應(yīng)用鈥激光治療腎腫瘤的研究報(bào)道。 我們擬通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究鈥激光對(duì)腎腫瘤的毀損效應(yīng)。

　　1.材料和方法

　　1.1材料成年健康新西蘭白兔30只，雌雄不限，體質(zhì)量2.0～2.5 kg， 4～5 mo齡（第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。 VX2瘤株種類為VX2鱗狀細(xì)胞癌（第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院實(shí)驗(yàn)外科）。 HE染色系列試劑（第四軍醫(yī)大學(xué)病理教研室）。 速眠新Ⅱ注射液（長(zhǎng)春軍需大學(xué)獸醫(yī)研究所）。  磷酸鹽緩沖液（PBS）和40 g/L多聚甲醛磷酸緩沖液（pH 7.4  APES）。 石蠟切片機(jī)（美國(guó)A0829）；HE染色機(jī)（日本櫻花公司）光學(xué)顯微鏡BX60（日本Olympus公司）；IBAS2000型電子計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)（德國(guó)Opton公司）；VersaPulse Powersuite  100W（美國(guó)科醫(yī)人公司）；SlimLine 550 micron Blue（美國(guó)科醫(yī)人公司）；Jacket Reusable Fiber和Sequoia512 型彩色超聲診斷儀（美國(guó)Acuson 公司）。

　　1.2方法

　　1.2.1動(dòng)物模型的建立

　　1.2.1.1接種用VX2瘤株的準(zhǔn)備把冰凍的VX2瘤株組織塊由液氮中取出，37℃水復(fù)蘇，生理鹽水沖洗，再用PBS液沖洗后切碎，300 r/min離心約5 min. 用18 G針頭l mL注射器抽吸瘤種備用。 將準(zhǔn)備好的瘤種注射液注入兔的后腿外側(cè)肌肉，2~3 wk后可在注射部位捫及明顯的質(zhì)地較硬的實(shí)質(zhì)性腫塊，即制成了荷瘤種兔。 依次剪開皮膚、筋膜，暴露VX2腫瘤組織，取出一部分腫瘤組織，放入盛有生理鹽水的托盤內(nèi)，去掉壞死的組織和筋膜，取生長(zhǎng)旺盛的魚肉樣組織放入無菌燒杯中，加少量生理鹽水，用剪刀盡量剪碎，然后加適量生理鹽水制成腫瘤組織混懸液，無菌空針抽吸備用。

　　1.2.1.2兔腎VX2腫瘤動(dòng)物模型的建立手術(shù)直視下腫瘤混懸組織液注射法（實(shí)驗(yàn)兔全部采用左腎接種）：左腎區(qū)常規(guī)消毒鋪巾，在左肋緣下約2.3 cm處，依次剪開皮膚、皮下組織、肌肉及腹膜，暴露左腎，將腎臟輕輕擠出腹腔，將準(zhǔn)備好的含腫瘤組織懸液的注射器從左腎下極進(jìn)針，沿腎長(zhǎng)軸在腎皮質(zhì)內(nèi)走行，邊退針邊將注射器中的腫瘤組織混懸液約0.5 mL輕輕推入腎皮質(zhì)內(nèi)，針尖退出的同時(shí)，助手用無菌明膠海綿壓迫止血并防止腫瘤組織溢出，然后將左腎放回原位，逐層縫合。 術(shù)后肌注青霉素4×105 U， 4 d. 接種12 d后行B超檢查種植腫瘤生長(zhǎng)情況，未發(fā)現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)者視為接種失敗。

　　1.2.2分組及處理將接種成功的荷腎VX2腫瘤兔26只隨機(jī)分為2組： ①實(shí)驗(yàn)組：21只行鈥激光腫瘤毀損實(shí)驗(yàn)。 根據(jù)分組提取動(dòng)物，速眠新Ⅱ注射液0.2～0.4 mL，兔臀部肌肉注射，麻醉滿意后將兔右側(cè)臥并固定于操作臺(tái)上。 應(yīng)用脫毛劑對(duì)手術(shù)區(qū)域進(jìn)行脫毛處理；碘酒、酒精消毒腹壁；在左肋緣下約2.3 cm處做一長(zhǎng)約8 cm的切口，依次剪開皮膚、皮下組織、肌肉及腹膜，充分暴露并游離左側(cè)腎臟，保持腎臟的良好血運(yùn)；設(shè)置鈥激光參數(shù)如下：脈沖能量（1.0 J）、照射頻率（40 Hz），參數(shù)的選擇依據(jù)為鈥激光對(duì)正常腎實(shí)質(zhì)的生物學(xué)效應(yīng)［6］。 將鈥激光光纖頭端插入18 G針頭，在直視下置入腫瘤包膜下約0.5 mm深處。 大致?lián)p毀腫瘤后退出；隨機(jī)處死實(shí)驗(yàn)組中16只動(dòng)物，解剖左腎，觀察鈥激光損毀灶大致形態(tài)，用鋼尺測(cè)量損毀腫瘤，按公式π/ 6 長(zhǎng)×寬×高計(jì)算損毀腫瘤體積［7］，記錄對(duì)應(yīng)之鈥激光總功率。 以損毀灶為中心，每隔1 mm切取組織至肉眼觀正常腎組織處，后置于40 g/L甲醛固定、石蠟包埋、切片，進(jìn)行HE染色； 未被處死的5只荷瘤兔待腎臟止血后，逐層縫合腹膜、皮下組織及皮膚。 術(shù)后青霉素4×105  U，  im，  3 d，2 wk后處死取左腎。 觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，并同上做HE染色病理檢查。 ②對(duì)照組：5只行假性治療。 同樣方法麻醉后開腹，在直視下將18 G針頭置入腫瘤包膜下約0.5 mm深處。 不接鈥激光治療儀，拔除針頭待腎臟止血后關(guān)腹。 術(shù)后青霉素4×105  U，  im，  3 d，2 wk后處死取左腎。 觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，同上測(cè)量并計(jì)算腫瘤體積并做HE染色病理檢查。

　　1.2.3HE染色、電子計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)分析將HE染色的切片在光學(xué)顯微鏡下觀察組織細(xì)胞學(xué)改變情況，顯微照相系統(tǒng)拍片，病理切片用圖像放大裝置及CCD相機(jī)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，采用電子計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行熱損傷帶厚度的測(cè)量。

　　1.2.4觀察指標(biāo)①鈥激光作用于腎腫瘤的肉眼觀察；②鈥激光損毀灶的體積及相應(yīng)鈥激光總功率；③組織病理學(xué)改變的觀察；④對(duì)照組腫瘤體積的測(cè)量及病理學(xué)改變。［醫(yī)學(xué) 教育網(wǎng) 搜集整理］

　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 數(shù)據(jù)以x±s表示，選用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用成組t檢驗(yàn)及直線回歸及相關(guān)性分析。

　　2.結(jié)果

　　2.1動(dòng)物模型的建立情況有26只種植腫瘤成功，并經(jīng)病理證實(shí)，接種成功率86.7%. 瘤灶中心均位于腎皮質(zhì)內(nèi)，除1只有2個(gè)瘤灶外，其他均只有1個(gè)瘤灶，瘤灶位置不固定，腎上、下極均有瘤灶發(fā)現(xiàn)。 瘤灶大小不固定。

　　2.2大體觀察在鈥激光處理時(shí)可見腫瘤結(jié)節(jié)表面的顏色由灰白色變?yōu)榘咨哪贪?，中間可見氣化的豁口，外圍有一圈充血淤血帶。 有少量出血、濺血現(xiàn)象，多在1~2 min內(nèi)自行停止。 無尿瘺發(fā)生。 解剖腎臟可見靶區(qū)內(nèi)中央灰白色魚肉樣腫瘤組織變?yōu)榘咨绦詨乃涝?，界限清楚，中間為汽化的缺損區(qū)，汽化區(qū)外為熱損傷帶。

　　2.3組織學(xué)檢查鈥激光照射后，光學(xué)顯微鏡下可見淺層為變性壞死帶，腫瘤細(xì)胞形態(tài)消失、核固縮、碎裂、融解，照射范圍足夠可觀察到深層為正常腎組織的充血瘀血帶，腎靜脈擴(kuò)張、瘀血，可見較多的炎細(xì)胞浸潤(rùn)和小片狀出血和血栓形成，腫瘤細(xì)胞少見，充血瘀血帶與正常組織分界清楚（圖1A，B）。 部分細(xì)胞核完全破裂，僅見胞質(zhì)內(nèi)核基質(zhì)成分。 電子計(jì)算機(jī)圖像分析：全部病理切片經(jīng)電子計(jì)算機(jī)圖像分析顯示，毀損灶外周熱損傷帶寬度均在400～800 μm之間（540±33） μm，照射時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)熱損帶寬度均無影響。 汽化豁口兩側(cè)和底部的熱缺損帶寬度無差異。

　　2.4鈥激光損毀灶的體積及相應(yīng)鈥激光總功率間的關(guān)系隨著激光輸出功率的增大腫瘤組織損傷灶亦增大。 應(yīng)用SPSS軟件繪制散點(diǎn)圖，進(jìn)行直線相關(guān)及回歸分析，表明兩者之間有良好的相關(guān)性（r=0.9521， t=12.06， P=0.000，）。

　　2.5對(duì)照實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的腫瘤體積分別為（1025.4±156.3）， （2645.5±174.2） mm3，兩者差異顯著（P<0.01）。 行病理學(xué)檢查見實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織已被完全破壞，鏡下觀同上。 對(duì)照組病理切片低倍鏡下可見腫瘤與腎實(shí)質(zhì)無明顯邊界的浸潤(rùn)性癌巢，癌細(xì)胞排列緊密呈實(shí)體巢狀，纖維間隔少。新生毛細(xì)血管豐富。間質(zhì)內(nèi)散在淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞，并于鄰近腎組織中可見散在的小癌巢和血管內(nèi)瘤栓；高倍鏡下見癌細(xì)胞染包深，大小和形態(tài)不一，胞漿豐富呈淡紅染色，未見角化珠；核大而圓，大小、形態(tài)不一，異形性明顯，核膜清楚，染色。

　　3.討論

　　VX2腫瘤起源于Shope病毒誘導(dǎo)的兔乳頭狀瘤衍生的鱗癌，是一種可移植的腫瘤細(xì)胞株［8］。 其組織類型雖為鱗癌，與臨床上最多見的腎癌類型不盡相同，但利用其制成的動(dòng)物模型仍為目前研究腎腫瘤的最佳途徑。  基于腎癌對(duì)放射治療和化學(xué)治療不敏感，目前對(duì)腎腫瘤的常規(guī)外科治療為腎切除術(shù)。 但在有些情況下，如孤立腎癌、對(duì)側(cè)腎功能低下、雙腎癌、手術(shù)不能耐受者、患者要求保留腎臟等，顯然并不適合行腎切除術(shù)。 目前針對(duì)如上情況一般采用腎部分切除術(shù)或是腫瘤剜除術(shù)，然而這兩種手術(shù)均存在手術(shù)復(fù)雜、難度大、技術(shù)要求高、術(shù)中出血多、術(shù)后并發(fā)癥多等缺點(diǎn)。 因此探索一種介入或是微創(chuàng)的手術(shù)治療方法，在腎腫瘤的外科治療中有著相當(dāng)?shù)囊饬x。

　　鈥激光的波長(zhǎng)2120 nm，非常接近水的1950 nm吸收峰，其吸收系數(shù)為24 cm-1，能很好地被生物組織吸收。 高功率的鈥激光被生物組織中的水分吸收后，在其光纖頭端產(chǎn)生溫度極高（可以使金屬熔化）、具有很高壓強(qiáng)和沖擊力的等離子泡［9］，使組織汽化、切割，而離子泡周圍傳導(dǎo)的熱量可使組織凝固壞死、凝血。 較低功率的鈥激光則通過組織直接吸收光能產(chǎn)生熱凝固效應(yīng)。 鈥激光的醫(yī)學(xué)應(yīng)用特點(diǎn)：①由于生物組織的熱傳導(dǎo)系數(shù)小，因此鈥激光導(dǎo)致的熱凝固損傷的范圍是一定的。 穿透深度淺，組織穿透度<0.5 mm，可用于精確的外科切割和止血；② 高能脈沖式。 因?yàn)殁€激光的這種生物學(xué)特性，在臨床各科室中已有了相當(dāng)?shù)膽?yīng)用，而其在腫瘤治療中的有效性和可行性研究也有一定的報(bào)道。［醫(yī)學(xué)教 育網(wǎng) 搜 集整理］

　　我們利用鈥激光的這種生物學(xué)特性，以制作的兔腎VX2腫瘤動(dòng)物模型為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，證實(shí)了鈥激光在腎腫瘤治療中的有效性和可行性。 采用照射強(qiáng)度參考了其對(duì)正常兔腎實(shí)質(zhì)的生物學(xué)效應(yīng)劑量，發(fā)現(xiàn)隨著激光輸出功率的增大腫瘤組織損傷灶亦增大。 在對(duì)治療組的全層切片檢查中，可見腫瘤原發(fā)組織被完全破壞。 在與對(duì)照組的比較中可見兩者顯著不同。 病理切片的電子計(jì)算機(jī)圖像分析顯示，在腫瘤組織汽化區(qū)外圍的熱損傷帶寬度較固定，均在400～800 μm之間，且汽化豁口四周的熱損傷帶寬度與豁口底部的熱損傷帶寬度相比無明顯差異，另外，熱損傷帶之外的正常腎組織切片檢查未見明顯損傷，表明了鈥激光的負(fù)損傷小。

　　利用鈥激光對(duì)腎腫瘤進(jìn)行治療具有臨床價(jià)值。 既可以在影像技術(shù)的引導(dǎo)下行穿刺介入治療，也可以在保腎手術(shù)中輔助切割，或者通過腹腔鏡進(jìn)行治療。

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