【摘要】  研究日本新近研制的第三代3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA， HMG-CoA）還原酶抑制劑匹伐他?。╬itavastatin， NK-104）對人肝癌細(xì)胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）活性的影響。方法：采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，以肝癌細(xì)胞系HepG 2為靶細(xì)胞，以不同濃度的藥物處理細(xì)胞48 h后，利用WST-8法測定NK-104對細(xì)胞增殖的影響；利用熒光染料Hoechst 33258染色，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核碎片；以流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期的變化；采用半胱氨酸蛋白酶3比色法檢測caspase-3活性。結(jié)果：NK-104（10 μmol/L）對HepG 2細(xì)胞有明顯抑制作用，可誘導(dǎo)HepG 2細(xì)胞凋亡，并能增強(qiáng)caspase-3基因的活性。結(jié)論：NK-104能夠誘導(dǎo)HepG 2細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與caspase-3依賴性凋亡調(diào)節(jié)信號通路有關(guān)。

　　【關(guān)鍵詞】  肝癌

　　3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA， HMG-CoA）還原酶抑制劑，統(tǒng)稱為抑制素，是重要的脂類合成抑制劑，主要在人體肝臟中代謝，臨床上廣泛應(yīng)用于治療高脂血癥［1］。 最近研究發(fā)現(xiàn)，HMG-CoA還原酶抑制劑具有生物學(xué)多效性，與降血脂無關(guān)。有報道其在體外具有抗癌作用［2］、體內(nèi)與5氟尿嘧啶（fluorouracil， 5-Fu）共同作用能夠延長晚期肝癌患者的生存期［3］。匹伐他?。╬itavastatin， NK-104）是日本新近研制的第三代高效HMG-CoA還原酶抑制劑［4］。在血管內(nèi)皮細(xì)胞系NK-104通過磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B， PI3K-Akt）基因激活途徑對內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用已有報道［5］，但其在肝癌細(xì)胞系的抗癌作用尚未見報道。本文在肝癌細(xì)胞系HepG 2通過2-（2-甲氧基-4-硝基苯）-3-（4-硝基苯）-5-（2，4-二硫代苯）-2H-四氮唑單鈉鹽 ｛［2-（2-methoxy-4-nitrophe-nyl）-3-（4-nitrophenyl）-5-（2，4-disulfophenyl）-2H-tetrazolium， monosodium salt］， WST-8｝、熒光染料Hoechst33258染色、流式細(xì)胞儀和半胱氨酸蛋白酶3比色法等檢測方法，研究NK-104對人肝癌細(xì)胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）活性的影響，為NK-104在抗腫瘤中的作用機(jī)制提供實驗依據(jù)。

　　1 材料和方法

　　1.1 主要材料與儀器 NK-104，日本興和有限公司（日本名古屋）和日產(chǎn)化學(xué)工業(yè)公司（日本東京）產(chǎn)品；熒光染料Hoechst 33258、甲羥戊酸（ mevalonic acid， MEV）和碘化丙啶（propidium iodide， PI）染色液（PI 100 g/L， 1% Triton 100， 9 g/L NaCl），Sigma公司產(chǎn)品。流式細(xì)胞儀，2000 FCA，美國BD公司產(chǎn)品。

　　1.2 實驗方法

　　1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株HepG 2（美國ATCC公司產(chǎn)品）在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)。實驗中，細(xì)胞種植于適當(dāng)培養(yǎng)皿中，90%的細(xì)胞融合時，用磷酸鹽緩沖液洗凈后，加入適量含有NK-104和MEV（ 1 mmol/L ）等藥物的培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

　　1.2.2 WST-8方法 利用WST-8試劑盒對細(xì)胞增殖進(jìn)行測定。HepG 2細(xì)胞（1×104個細(xì)胞/孔）接種于含100 μl培養(yǎng)液的96孔培養(yǎng)板中，NK-104（ 0.1 ～100 μmol/L）治療48 h后，分別加入WST-8試劑10 μl（日本同仁化學(xué)研究所）培養(yǎng)2 h后，選擇450 nm波長，測定各孔的吸光度OD值。

　　1.2.3 Hoechst 33258染色 細(xì)胞經(jīng)藥物刺激 48 h 后，甲醇-冰乙酸（3∶1）細(xì)胞固定液4 ℃固定5 min，磷酸鹽緩沖液稍洗后，點加Hoechst 33258染色液， 10 min .用濾紙沾去多余液體，封片劑封片后熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核碎片。

　　1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測凋亡峰 在室溫下將刺激48 h后的細(xì)胞用冷磷酸鹽緩沖液洗滌2次，并在適當(dāng)?shù)娜旧彌_液中吸取100 μl的細(xì)胞（1×105）至試 管中。加入200 μl RNase A，37 ℃水浴30 min，再加800 μl PI染色液混勻，4 ℃避光30 min后，立即上機(jī)分析。

　　1.2.5 半胱氨酸蛋白酶3比色法 經(jīng)藥物治療 48 h 后收集細(xì)胞，采用半胱氨酸蛋白酶3比色法試劑盒按照廠家說明進(jìn)行測定（Medical & Biological Laboratories Co.， LTD， Japan）。

　　1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)均以 x ± s 表示，采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用 t 檢驗。

　　2 結(jié)果

　　2.1 NK-104對HepG 2細(xì)胞增殖的抑制作用 為了確定NK-104在人肝癌細(xì)胞HepG 2中的治療濃度，采用WST-8方法對細(xì)胞的增殖作用進(jìn)行測定。與對照組相比，NK-104在10和100 μmol/L時，對HepG 2細(xì)胞生長均有明顯的抑制作用。 100 μmol/L 時，近50%的細(xì)胞死亡（ P <0.01）。見圖1.

　　圖1 不同濃度NK-104對HepG 2生長的抑制作用（略）

　　Figure 1 Growth inhibition of HepG 2 cells by NK-104

　　**P <0.01， vs control group.

　　2.2 NK-104誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化 對照組細(xì)胞界限清晰，胞漿豐富，細(xì)胞核呈彌散、均勻熒光分布，經(jīng)10～100 μmol/L NK-104處理后，HepG 2發(fā)生細(xì)胞凋亡，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見濃染致密的藍(lán)色熒光顆粒及明顯核形態(tài)變化。見圖2.

　　2.3 NK-104對HepG 2細(xì)胞周期的影響 與對照組相比，NK-104治療組可明顯誘導(dǎo)HepG 2的細(xì)胞凋亡，出現(xiàn)相當(dāng)比例的DNA含量小于二倍體的亞G1凋亡峰（24%），不同周期細(xì)胞的比例也發(fā)生變化，與MEV共同作用后可消除NK-104的這種誘導(dǎo)作用。見圖3.

　　2.4 NK-104對caspase-3活性的影響 與對照組相比，NK-104可明顯誘導(dǎo)caspase-3活性（ P < 0.01 ），同樣加入MEV能夠消除NK-104的這種誘導(dǎo)作用。見圖4.

　　圖2 NK-104處理48 h后HepG 2細(xì)胞核的形態(tài)變化（Hoechst33258染色， ×400）（略）

　　Figure 2 Nuclear morphology of the HepG 2 cells treated by NK-104 for 48 hours （Hoeschst 33258 staining， ×400）

　　A： Control， normal nuclear structure； B： NK-104 10 μmol/L； C： NK-104 100 μmol/L； ●： Cytoplasmic change； ■： Nuclear fragmentation.

　　圖3 NK-104治療HepG 2細(xì)胞后細(xì)胞周期分布變化（略）

　　Figure 3 Cell cycle analysis of HepG 2 cells treated by NK-104 （Percentage of Sub G1cells）

　　**P <0.01， vs control group. A： Control； B： NK-104 10 μmol/L； C： NK-104+MEV.

　　圖4 NK-104對caspase-3活性的影響（略）

　　Figure 4 NK-104 induced activity of caspase-3

　　**P <0.01， vs control group. The HepG 2 cells were exposed to NK-104 （10 μmol/L） alone， or NK-104 （10 μmol/L） plus MEV （1 mmol/L） for 48 hours. The caspase-3 activity was measured with a colorimetric protease assay.

　　3 討論

　　目前認(rèn)為惡性腫瘤是一種多基因異常的疾病，其發(fā)生的分子基礎(chǔ)是原癌基因的激活或抑癌基因的突變失活或缺失，導(dǎo)致某些細(xì)胞分化不良、凋亡受阻和增殖失控而形成腫瘤。原發(fā)性肝癌約55%發(fā)生在中國［6］。肝癌細(xì)胞的凋亡在肝癌的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)歸 及治療等方面均有重要的意義。HMG-CoA還原酶抑制劑，是重要的脂類合成抑制劑，臨床上廣泛應(yīng)用于治療高脂血癥。最近研究表明，HMG-CoA還原酶抑制劑具有抗感染、降低炎性細(xì)胞因子水平及抗癌等生物學(xué)多效性作用。Otsuki等［7］報道1～30 μmol/L的西米伐他汀 （simvastatin） 具有預(yù)防癌癥的作用。Sutter等［8］研究認(rèn)為1～10 μmol/L的弗魯伐他?。╢luvastatin）通過誘導(dǎo)Huh 7細(xì)胞凋亡而抑制肝癌細(xì)胞的增殖。Denoyelle等［9］認(rèn)為25 μg/L的賽里伐他?。╟erivas-tatin）對MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞通過抑制細(xì)胞核因子κB活性起到重要的抗轉(zhuǎn)移作用。HepG 2細(xì)胞具有典型肝癌細(xì)胞的一系列惡性特征，是研究和評價防治肝癌藥物的較理想的細(xì)胞模型。NK-104是日本新近研制的第三代HMG-CoA還原酶抑制劑，具有副作用小、高效和強(qiáng)力的藥代動力學(xué)特點［4］。我們的研究結(jié)果表明，NK-104對HepG 2細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，其最大抑制率可達(dá)50%左右，使HepG 2細(xì)胞呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)特征，核質(zhì)濃集，有凋亡小體。提示NK-104能在一定程度上抑制肝癌細(xì)胞的增殖。流式細(xì)胞術(shù)具有檢測的細(xì)胞數(shù)量大、反映群體細(xì)胞的凋亡狀態(tài)比較準(zhǔn)確等優(yōu)點［10］。NK-104作用于HepG 2細(xì)胞后，通過流式細(xì)胞儀分析，與對照組相比，可見凋亡細(xì)胞出現(xiàn)在直方圖亞二倍體峰位置，并與細(xì)胞主峰G0/G1分界清楚，可定量凋亡占整個細(xì)胞群百分比。本研究結(jié)果表明，NK-104可明顯誘導(dǎo)HepG 2細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡的核心成分是半胱氨酸蛋白酶家族（caspase），其中研究最多，功能相對較明確的為caspase-3.caspase-3是哺乳動物細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶之一，為凋亡的效應(yīng)分子，被稱為凋亡的“執(zhí)行者”［11～13］。激活的caspase-3可裂解相應(yīng)的胞核內(nèi)底物DNA修復(fù)酶（poly ADP-ribose polymerase， PARP），使PARP失去對DNA的修復(fù)功能，導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)向凋亡［14］。本研究表明，10 μmol/L NK-104能夠增強(qiáng)caspase-3的活性，加入MEV能夠消除NK-104的這種誘導(dǎo)作用。這一研究結(jié)果表明，NK-104誘導(dǎo)HepG 2細(xì)胞凋亡與激活caspase-3依賴性凋亡調(diào)節(jié)信號通路有關(guān)。

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