【摘要】  探討電針大鼠胃經(jīng)穴后提取的血清對胃黏膜細(xì)胞表皮生長因子受體（epidermal growth factor recep-tor， EGFR）后信息物質(zhì)磷脂酶Cγ-1（phospholipase Cγ-1，PLCγ-1）、蛋白激酶C（protein kinase C， PKC）和c-myc表達(dá)的影響。方法：60只大鼠隨機分為正常組、胃經(jīng)組、膽經(jīng)組、胃經(jīng)+PD153035組和膽經(jīng)+PD153035組，采用水浸束縛法制作胃黏膜損傷大鼠模型，鏈霉蛋白酶消化法分離胃黏膜細(xì)胞，分別用EGFR抑制劑PD153035和血清孵育胃黏膜細(xì)胞，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法檢測PLCγ-1活性，同位素?fù)饺敕z測PKC活性，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法檢測c-myc的表達(dá)水平。結(jié)果：正常組大鼠胃黏膜細(xì)胞PLCγ-1、PKC和c-myc有微弱表達(dá)；胃經(jīng)組和膽經(jīng)組大鼠胃黏膜細(xì)胞 PLCγ-1、 PKC和c-myc呈現(xiàn)較強表達(dá)，其中胃經(jīng)組大鼠表達(dá)最強烈，兩組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.01）；胃經(jīng)+PD153035組和膽經(jīng)+PD153035組大鼠胃黏膜細(xì)胞 PLCγ-1 、PKC和c-myc的表達(dá)較弱，胃經(jīng)組與胃經(jīng)+PD153035組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.01）。結(jié)論：電針胃經(jīng)穴后提取的血清能誘導(dǎo)大鼠胃黏膜細(xì)胞EGFR后信息物質(zhì)的活化，提示存在經(jīng)脈-臟腑的特異性聯(lián)系。

　　【關(guān)鍵詞】  電針

　　胃黏膜損傷是消化系統(tǒng)疾病中常見的一種病理反應(yīng)，目前臨床和實驗研究皆證實針刺對胃黏膜損傷有很好的修復(fù)作用［1， 2］，并且發(fā)現(xiàn)表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor， EGFR）與胃黏膜損傷修復(fù)密切相關(guān)，對胃黏膜的保護(hù)及其損傷的修復(fù)有很重要的作用［3］。EGFR屬于跨膜受體酪氨酸蛋白激酶家族，EGFR的活化可激活I(lǐng)P3/Ca2+和DG/PKC雙信號系統(tǒng)以及Fos/Jun相關(guān)的Ras/Raf/MAPK依賴途徑，從而引起細(xì)胞的增殖、分化、黏附和遷移等。細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在介導(dǎo)細(xì)胞的分裂和增殖過程中起著重要的作用，然而目前對針刺參與胃黏膜損傷修復(fù)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制尚未完全明了。為了進(jìn)一步探討針刺參與胃黏膜損傷修復(fù)的信號傳導(dǎo)途徑，本實驗觀察電針大鼠胃經(jīng)穴后提取的血清對胃黏膜細(xì)胞EGFR后信使物質(zhì)表達(dá)的影響，為更深入揭示針刺作用的體液機制及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制提供理論依據(jù)。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料 Pronase，德國默克公司產(chǎn)品；Trypan blue，美國Biomedicals生物醫(yī)學(xué)公司產(chǎn)品；AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNasin、dNTPs、Taq DNA聚合酶、100 bp DNA ladder、二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbon-ate， DEPC）、OligDT18和瓊脂糖，均為美國Pro-mega公司產(chǎn)品；Trizol試劑盒，美國Invitrogen公司產(chǎn)品；［γ-32P］ATP，北京福瑞公司產(chǎn)品；磷脂酶Cγ-1（phospholipase Cγ-1， PLCγ-1）免疫測定試劑盒，美國Biosource公司產(chǎn)品；蛋白激酶C（protein kinase C， PKC）檢測試劑盒，美國Upstate公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

　　1.2 動物分組及處理 SD大鼠60只，清潔級，體質(zhì)量170～230 g，雌雄兼配，均購自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)實 驗動物中心（許可證號：20030316）。大鼠在自然光暗周期的室溫環(huán)境中分組飼養(yǎng)，自由飲水和進(jìn)食。隨機分為正常組、胃經(jīng)組、膽經(jīng)組、胃經(jīng)+PD153035組和膽經(jīng)+PD153035組，每組12只。各組皆隨機選4只大鼠用于提取血清，其中正常組大鼠不予造模，亦不予電針，其余四組在制作胃黏膜損傷大鼠模型后當(dāng)日即予電針，并于電針7 d后即提取血清；每組的另8只大鼠不予任何處理，僅用于分離大鼠正常胃黏膜細(xì)胞。胃經(jīng)組取四白、梁門、足三里三個穴位，膽經(jīng)組取陽白、日月、陽陵泉三個穴位，取穴采用華興邦動物穴位圖譜并結(jié)合模擬人體經(jīng)穴法［4］進(jìn)行。電針刺激用G6805型電針儀，胃經(jīng)組電極接同側(cè)的足三里（負(fù)極）和梁門（正極），膽經(jīng)組電極接同側(cè)的陽陵泉（負(fù)極）和日月（正極），采用疏密波，電針頻率疏波4 Hz，密波20 Hz，強度以肌肉或針柄微顫為度，電針時間30 min，1次/d，共10 d.

　　1.3 實驗動物模型 采用水浸束縛法制作胃黏膜損傷大鼠模型，具體方法參見文獻(xiàn)［5］。

　　1.4 大鼠胃黏膜細(xì)胞懸液的制備 采用鏈霉蛋白酶消化法分離大鼠胃黏膜細(xì)胞［6］，將分離的胃黏膜細(xì)胞用無血清的DMEM培養(yǎng)基懸浮，并將細(xì)胞濃度調(diào)至106/ml.

　　1.5 血清制備及處理 大鼠電針結(jié)束后即行頸動脈取血，將血移入離心管中，37 ℃下靜置2 h， 2 500 r/min 離心10 min（離心半徑3.5 cm），用吸管小心吸取血清，將同組血清混合，過濾除菌，EP管分裝，-20 ℃凍存。實驗時將胃黏膜細(xì)胞懸浮液與 10 μmol/L PD153035在37 ℃下共同孵育30 min，然后用100 ml/L稀釋度的血清在37 ℃下與胃黏膜細(xì)胞共同孵育30 min后即行指標(biāo)檢測。

　　1.6 大鼠胃黏膜細(xì)胞PLCγ-1的檢測 將處理好的胃黏膜細(xì)胞用冰冷的PBS洗2次，去掉上清液，收集細(xì)胞沉淀物，在冰上將細(xì)胞沉淀物溶解于細(xì)胞抽提液A（10 mmol/L Tris，pH 7.4，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L EGTA， 1 mmol/L NaF，20 mmol/L Na 4P2O7，2 mmol/L Na3VO4，1% Triton X-100，10% glycerol，0.1% SDS，0.5% deoxycholate，1 mmol/L PMSF）中 30 min ，每隔10 min用渦流器震動1次，然后將細(xì)胞抽提物移入超微離心管中，在4 ℃下以 13 000 r/min 速度離心10 min（離心半徑2.5 cm），Lowry法測定膜蛋白含量。其余步驟參照PLCγ-1免疫測定試劑盒進(jìn)行，最后在酶標(biāo)儀上讀取吸光度值，計算機自動擬合四參數(shù)曲線并計算樣本內(nèi)PLCγ-1濃度。

　　1.7 大鼠胃黏膜細(xì)胞PKC的檢測 將處理好的胃黏膜細(xì)胞懸液在冰上用預(yù)冷的PBS洗2次，然后超速離心2 min，12 000 r/min（離心半徑2.5 cm），倒掉上清液，留取細(xì)胞沉淀，按每1×106滴入細(xì)胞抽提液B（20 mmol/L Tris/HCl，pH7.5， 0.25%蔗糖，10 mmol/L EGTA，20 mmol/L EDTA）1 ml，用超聲粉碎機粉碎，每次20 s，共5次，然后在3 300× g 離心10 min，取上清液，應(yīng)用Lowry法進(jìn)行蛋白定量，其余步驟參照PKC檢測試劑盒進(jìn)行，于閃爍儀中測放射活性，蛋白激酶C比活性單位用 nmol/（g.min） 表示。

　　1.8 大鼠胃黏膜細(xì)胞c-myc基因的檢測 c-myc mRNA及內(nèi)參GAPDH隨機引物由Invitrogen生物技術(shù)公司合成，引物序列如下：c-myc上游，5‘-TCAAGAGGCCACAGCAAAC-3’，下游，5‘-AAAAGCTACGCTTCAGCTCG-3’；GAPDH上游，5‘-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTC-3’，下 游，5‘-AAGGCCATGCCAGTGAGCTTC-3’。抽提大鼠胃黏膜細(xì)胞總RNA后依次進(jìn)行RNA鑒定及RT-PCR反應(yīng)（按試劑盒說明書操作），最后取擴增液做瓊脂糖凝膠電泳。待電泳完成后，取出凝膠，存入凝膠成像分析系統(tǒng)待分析，以目的基因與GAPDH的電泳帶面積灰度值比作為該例標(biāo)本的基因表達(dá)的相對數(shù)值。

　　1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間比較若方差齊時選擇LSD法，方差不齊時選擇Dunnett‘s T3法進(jìn)行方差分析和兩兩比較。

　　2 結(jié)果

　　2.1 大鼠胃黏膜細(xì)胞PLCγ-1表達(dá) 胃經(jīng)組大鼠胃黏膜細(xì)胞PLCγ-1表達(dá)與正常組、膽經(jīng)組和胃經(jīng)+PD153035組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（ P < 0.01）； 膽經(jīng)組大鼠胃黏膜細(xì)胞PLCγ-1表達(dá)與膽經(jīng)+PD153035組比較，差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（ P < 0.01）。 見表1.

　　2.2 大鼠胃黏膜細(xì)胞PKC表達(dá) 胃經(jīng)組大鼠胃黏膜細(xì)胞PKC表達(dá)與正常組、膽經(jīng)組和胃經(jīng)+PD153035組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.01 ）； 膽經(jīng)組大鼠胃黏膜細(xì)胞PKC表達(dá)與膽經(jīng)+PD153035組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1.

　　2.3 大鼠胃黏膜細(xì)胞c-myc基因表達(dá) 胃經(jīng)組大鼠胃黏膜細(xì)胞c-myc基因表達(dá)與正常組、膽經(jīng)組和胃經(jīng)+PD153035組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（ P < 0.01）；膽經(jīng)組大鼠胃黏膜細(xì)胞c-myc基因表達(dá)與膽經(jīng)+PD153035組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.01）。見表1、圖1.

　　表1 各組大鼠胃黏膜細(xì)胞PLCγ-1、c-myc基因和PKC的表達(dá)（略）

　　Table 1 Expressions of PKC， c-myc gene and PLCγ-1 in gastric mucosal cells in 5 groups

　　**P <0.01， vs normal group；△△P <0.01， vs stomach meridian group；▲P <0.05，▲▲P <0.01， vs gallbladder meridian group.

　　圖1 大鼠胃黏膜細(xì)胞c-myc基因和內(nèi)參GAPDH基因PCR產(chǎn)物電泳圖（略）

　　Figure 1 Electrophoretogram of c-myc gene and GAPDH gene RT-PCR product in gastric mucosal cells

　　M： Marker； A： Normal group； B： Stomach meridian group； C： Gallbladder meridian group； D： Stomach meridian + PD153035 group； E： Gallbladder meridian + PD153035 group.

　　3 討論

　　胃黏膜保護(hù)是指胃黏膜長期暴露于腔內(nèi)各種理化因素的廣泛變化而不受損傷的一種防御機制，參與黏膜防御和黏膜損傷修復(fù)的各種因素被看成是一個相互聯(lián)系相互作用的網(wǎng)絡(luò)體系。以往臨床資料表明針刺足陽明經(jīng)穴能增強胃黏膜的保護(hù)作用，對胃腸疾病有很好的療效，實驗研究亦顯示針刺胃經(jīng)穴對胃電、胃運動、胃分泌、胃黏膜血流量等均有明顯調(diào)整作用，對胃黏膜損傷有很好的修復(fù)作用，并且認(rèn)為針刺對胃黏膜的保護(hù)和修復(fù)效應(yīng)與胃泌素、胃動素、P物質(zhì)和生長抑素等腦腸肽密切相關(guān)［7～9］。 研究表明在胃黏膜損傷修復(fù)中有EGFR的高度表達(dá)，對胃黏膜的保護(hù)及其損傷的修復(fù)有很重要的作用［10］，故EGFR及其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與胃黏膜損傷修復(fù)的關(guān)系日益受到人們的關(guān)注與重視，其效應(yīng)是當(dāng)配體與EGFR結(jié)合可引起erbB家族成員內(nèi)部二聚體受體復(fù)合物的形成，激活該受體的酪氨酸蛋白激酶，結(jié)合一個ATP分子，啟動一系列級聯(lián)反應(yīng)，與下游含有SH2和PTB區(qū)域的信號分子（如PLCγ-1）結(jié)合，并進(jìn)一步激活I(lǐng)P3/Ca2+和DG/PKC雙信號系統(tǒng)以及Fos/Jun相關(guān)的Ras/Raf/MAPK依賴途徑，活化的MAPK將諸如c-myc，c-jun和 c-fos 等轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，然后進(jìn)入核內(nèi)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，從而引起細(xì)胞的分裂增殖［11］。針刺對胃黏膜損傷修復(fù)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制是否通過EGFR介導(dǎo)PLCγ-1活化并進(jìn)一步激活I(lǐng)P3/Ca2+和DG/PKC雙信號系統(tǒng)以及Ras信號通路目前尚未完全明了。 本實驗利用電針胃經(jīng)穴后提取的血清孵育大鼠胃黏膜細(xì)胞，然后觀察其對細(xì)胞效應(yīng)的影響，結(jié)果顯示電針胃經(jīng)穴后提取的血清能明顯提高大鼠胃黏膜細(xì)胞PLCγ-1，PKC以及c-myc的表達(dá)，經(jīng)PD153035阻斷EGFR后其表達(dá)皆減弱，說明電針胃經(jīng)穴對胃黏膜損傷的修復(fù)過程中的確有體液機制 的參與，并且電針胃經(jīng)穴后所提取的血清可能通過EGRR介導(dǎo)PLCγ-1活化并進(jìn)一步激活I(lǐng)P3/Ca2+和DG/PKC雙信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和Fos/Jun相關(guān)的Ras/Raf/MAPK依賴途徑，從而誘導(dǎo)胃黏膜細(xì)胞的增殖。本研究還發(fā)現(xiàn)電針膽經(jīng)穴后提取的血清孵育的大鼠胃黏膜細(xì)胞PLCγ-1、PKC和c-myc的表達(dá)明顯弱于電針胃經(jīng)穴提取的血清，但高于正常大鼠血清，說明經(jīng)穴臟腑確實存在一定的特異性聯(lián)系，其血清中存在的相關(guān)物質(zhì)及其作用機制有待從蛋白質(zhì)組學(xué)上作進(jìn)一步研究。

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