【摘要】  通過觀察C57BL/6小鼠皮膚局部血管新生及毛囊中血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）的表達，探討活血補腎合劑促進小鼠毛發(fā)生長的可能機制。方法：以熱松香和石蠟混合物脫毛法誘導C57BL/6小鼠休止期毛囊進入生長期，建立動物模型。90只小鼠隨機分為活血補腎合劑組、養(yǎng)血生發(fā)膠囊組和模型組。造模后第1天起開始灌藥，每天觀察各組小鼠皮膚毛發(fā)生長情況，并分別于造模后第4、11、17天每組分批處死10只小鼠，病理切片計數(shù)拔毛部位的血管數(shù)，并以免疫組織化學方法檢測毛囊中VEGF表達情況。結果：活血補腎合劑組局部新生血管數(shù)第4天時多于模型組（ P <0.05），第11天時明顯多于養(yǎng)血生發(fā)膠囊組和模型組（ P <0.05）；活血補腎合劑組毛囊中VEGF的表達在第11天和第17天時均明顯高于養(yǎng)血生發(fā)膠囊組和模型組（ P <0.05）。結論：活血補腎合劑可能是通過調節(jié)細胞因子水平，起到促進血管新生和毛發(fā)生長的作用。

　　【關鍵詞】  中醫(yī)藥；血管；血管內皮細胞生長因子；免疫組織化學；毛囊；小鼠

　　活血補腎合劑（Huoxue Bushen Mixture， HXBSM） 是龍華醫(yī)院皮膚科經(jīng)驗方，臨床治療脫發(fā)取得了良好的療效［1］。本實驗觀察活血補腎合劑對小鼠毛發(fā)生長、局部血管新生及毛囊中血管內皮細胞生長因子 （vascular endothelial growth factor， VEGF）表達的影響，旨在從微觀結構和細胞因子水平對活血補腎合劑促進毛發(fā)生長作用的機制加以闡釋。

　　1 材料與方法

　　1.1 實驗材料

　　1.1.1 動物 C57BL/6小鼠，普通級，8周齡，體質量（20±2）g，雄性，由上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。

　　1.1.2 藥物來源與制劑加工 活血補腎合劑由地黃30 g、丹參40 g、益母草20 g、玄參15 g、黃芪 40 g 、黨參20 g、麥冬15 g、豬苓20 g、金錢草40 g、白花蛇舌草40 g共10味中藥組成，由龍華醫(yī)院制劑室制備（滬藥制字z05170520），含生藥4 g/ml.養(yǎng)血生發(fā)膠囊（熟地黃、當歸、羌活、木瓜、制何首烏等）由廣州敬修堂藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號030263.生理鹽水，上海市富民制藥廠生產(chǎn)。

　　1.2 造模、分組及藥物處理

　　1.2.1 動物模型建立 參考文獻［2］建立動物模型，將按1∶1的比例混合的松香和石蠟加熱融化后涂于C57BL/6小鼠背部，凝固變硬后揭去，從而達到脫毛的效果。每只小鼠脫毛區(qū)域約為2 cm×2 cm.

　　1.2.2 動物分組及藥物處理 按《藥理與中藥藥理實驗》［3］人鼠等效劑量換算方法計算各種藥物的人鼠等效劑量。C57BL/6小鼠，共90只，隨機分為 3組 ，每組30只。活血補腎合劑組，以生藥 25 g/（kg.d） 劑量灌飼；養(yǎng)血生發(fā)膠囊（Yangxue Shengfa Capsule， YXSFC）組，以0.36 g/（kg.d）劑量灌飼； 模型組，生理鹽水0.4 ml/d灌胃。以上 3組 每天灌服藥物1次，從造模后第1天起，連續(xù)給藥17 d.

　　1.3 檢測指標與方法

　　1.3.1 肉眼觀察 各組小鼠拔毛局部皮色變化及毛發(fā)生長情況。

　　1.3.2 光學顯微鏡下觀察 分別于造模后第4、 11天 用斷頸法每組隨機處死10只小鼠，第17天用 同樣方法處死各組剩余小鼠。在每只小鼠拔毛部位切取新鮮皮膚標本，固定于10%中性甲醛，經(jīng)脫水，透明，滲蠟，包埋，連續(xù)切片，并進行HE染色，觀察真皮淺層毛細血管數(shù)（條）。以200倍視野計數(shù)，每張切片數(shù)5個視野，計算平均值［4］。

　　1.3.3 檢測VEGF表達 采用免疫組織化學法。

　　1.3.3.1 檢測方法 免疫組化Envision二步法測定VEGF（VEGF抗體為Santa Cruz Biotechnology 公司產(chǎn)品，工作濃度1∶25～1∶50），與HE染色同步進行。

　　1.3.3.2 圖像分析 采用Leica DMIRB倒置像差顯微鏡和 Leica Q 500 IW圖像分析儀，選擇200倍視野，每張免疫組化切片任選2個視野，分析視野中免疫組化切片染色陽性面積占整個視野面積的百分比。

　　1.4 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)用 x ± s 表示。采用SPSS for Windows軟件包進行完全隨機設計資料的兩因素方差分析。

　　2 結果

　　2.1 各組小鼠拔毛局部毛發(fā)生長情況 各組小鼠在造模時皮膚均為粉紅色；HXBSM組和YXSFC組在造模后第4～5天局部皮膚變黑，第8～9天出現(xiàn)新生毛發(fā)，第17天皮膚變灰；而模型組約在第 6天 皮膚變黑，第11天出現(xiàn)新生毛發(fā)，第17天皮膚變灰。其中皮膚變黑的時間頭端早于尾端。

　　2.2 對小鼠皮膚局部血管新生的影響 因實驗過程中有動物死亡，各組第4和11天均處死10只，第17天HXBSM組和YXSFC組均處死9只，模型組處死8只。同組小鼠不同時間拔毛局部真皮淺層毛細血管數(shù)相比，HXBSM組在造模后第11天和第17天時明顯多于第4天（ P <0.05），模型組第 17天 時明顯多于第4天和第11天（ P <0.05）；同一時間不同組別相比，第4天和第11天時HXBSM組新生血管數(shù)較模型組增加（ P <0.05），YXSFC組第11天時新生血管數(shù)較模型組增加（ P < 0.05 ）；而第11天時，HXBSM組明顯多于YXSFC組（ P <0.05）；第17天時，3組小鼠局部毛細血管數(shù)目相比，差異無統(tǒng)計學意義（ P >0.05）。見表1.

　　2.3 對小鼠皮膚局部毛囊中VEGF表達的影響 同組小鼠不同時間拔毛局部毛囊中VEGF的表達相比，HXBSM組和YXSFC組在造模后第11天高于第4天（ P <0.05），第17天高于第11天和第 4天 （ P <0.05）；模型組在第11天和第17天高于第4天（ P <0.05），而第11天和第17天相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。同一時間不同組別相 比，第4天時各組小鼠毛囊中VEGF的表達量差異無統(tǒng)計學意義（ P >0.05）；第11天和第17天時，HXBSM組VEGF的表達量高于YXSFC組和模型組（ P <0.05）；第17天YXSFC組VEGF的表達量高于模型組（ P <0.05）。見表1、圖1.

　　表1 各組小鼠局部血管新生和皮膚局部毛囊中VEGF表達（略）

　　Table 1 Skin blood vessel neogenesis and expression of VEGF in hair follicle of mice in three groups

　　*P <0.05， vs day 4；△P <0.05， vs day 11；▲P <0.05， vs untreated group；□P <0.05， vs YXSFC group.

　　圖1 第11天各組毛囊中VEGF的表達情況（略）

　　Figure 1 The eleventh day‘s VEGF expression of mice hair follicle in three groupsA： HXBSM group； B： YXSFC group； C： Untreated group.

　　3 討論

　　臨床上，我們發(fā)現(xiàn)脫發(fā)患者以青壯年居多。患者生活節(jié)奏快，心理壓力大，造成勞傷心脾，或肝郁氣滯，或暗耗腎精。由此導致了濕阻、血瘀或腎虛，氣血不能上達頭部，毛發(fā)失于精血的濡養(yǎng)而脫落。故治療脫發(fā)應以“活血、利濕、補腎”為治則，而活血補腎合劑正是以這一原則組方。我們臨床以該方治療腎虛血瘀型脫發(fā)，為期3個月的臨床觀察顯示，治療組痊愈率和顯效率分別為44%和36%，明顯優(yōu)于首烏片對照組的12%和28%（ P <0.05），并且對頭痛失眠、腰酸乏力等腎虛血瘀的證候改善也明顯優(yōu)于首烏片對照組（ P <0.05）［5］。本實驗所選的C57BL/6小鼠在6～8周飼養(yǎng)良 好的情況下，所有毛囊均由生長期進入休止期，且生理狀態(tài)下不再自發(fā)進入生長期。經(jīng)人工脫毛或拔毛等創(chuàng)傷刺激后可誘導其毛發(fā)進入生長期，并可自發(fā)經(jīng)過退行期再進入休止期。這個周期活動與自然周期無明顯差別［6］。該小鼠軀干皮膚的黑素細胞只存在于毛囊中，而且僅在生長期合成黑素并傳遞給角質形成細胞，使皮膚變成黑色，而退行期皮膚變成灰色，休止期皮膚變?yōu)榉奂t色，因此可根據(jù)皮膚顏色大致判斷毛發(fā)周期與毛發(fā)生長情況［2］。本研究觀察各組小鼠毛發(fā)生長情況，HXBSM組小鼠毛發(fā)進入生長期和長出的時間均早于模型組，而各組進入退行期的時間相當，表明活血補腎合劑可促進小鼠毛發(fā)進入生長期，并可促進毛發(fā)生長，但不能延長或縮短小鼠毛發(fā)固有的自然周期。Castex-Rizzi等［7］發(fā)現(xiàn)VEGF及其受體僅在生長期毛囊（主要在外毛根鞘、毛母質和毛乳頭）表達，進入退行期后逐漸降低，在休止期則基本消失，進一步證實VEGF對毛囊生長周期和毛發(fā)生長具有正相調節(jié)的重要作用。本研究結果則表明，活血補腎合劑可明顯提高小鼠拔毛局部毛囊VEGF的表達。推測活血補腎是通過調節(jié)細胞因子水平，達到促進血管新生、促進毛發(fā)生長的作用。

　　【參考文獻】

　　1Li YM， Song Y， Ma SY. Observation of curative effects of Huoxue Bushen Mixture on 317 patients with alopecia. Zhejiang Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 2004； 14（7）： 440-441. Chinese. 李詠梅， 宋瑜， 馬紹堯。 活血補腎合劑治療脫發(fā)317例療效觀察。 浙江中西醫(yī)結合雜志。 2004； 14（7）： 440-441.

　　2Slominski A， Paus R. Melanogenesis is coupled to mu-rine anagen： toward new concepts for the role of mela-nocytes and the regulation of melanogenesis in hair growth. J Invest Dermatol. 1993； 101（1 Suppl）： 90s-97s.

　　3Zhang DF. Experiments of pharmacology and tradition-al Chinese medicine pharmacology. Shanghai： Shang-hai Scientific and Technical Publishers. 2002： 8-10.Chinese. 張大方。 藥理與中藥藥理實驗。 上海： 上海科學技術出版社。 2002： 8-10.

　　4Wang T， Song HY， Zhang WM. Hair growth effect of Zhituo Shengfa Tincture. Shanghai Shi Yan Dong Wu Ke Xue. 2004； 24（2）： 99-100， 108. Chinese. 王婷， 宋懷燕， 張文明。 止脫生發(fā)酊生發(fā)作用的實驗研究。 上海實驗動物科學。 2004； 24（2）： 99-100， 108.

　　5 Gao SP， Li YM， Gu MJ. Clinical observation of “Huoxue Bushen Mixture” in treating alopecia areata of kidney deficiency and blood stasis. Shanghai Zhong Yi Yao Za Zhi. 2005； 39（7）： 39-41. Chinese with ab-stract in English. 高尚璞， 李詠梅， 顧敏婕。 活血補腎合劑治療腎虛血瘀型斑禿的臨床觀察。 上海中醫(yī)藥雜志。 2005； 39（7）： 39-41.

　　6Paus R， Handjiski B， Czarnetzki BM， et al. A murine model for inducing and manipulating hair follicle re-gression （catagen）： effects of dexamethasone and cy-closporin A. J Invest Dermatol. 1994； 103（2）： 143-147.

　　7Castex-Rizzi N， Lachgar S， Charveron M， et al. Impli-cation of VEGF， steroid hormones and neuropeptides in hair follicle cell responses. Ann Dermatol Venereol. 2002； 129（5 Pt 2）： 783-786.