【摘要】目的：研究脊髓背角膠質(zhì)層神經(jīng)元在超極化脈沖刺激下的細胞膜反應性，揭示神經(jīng)元在超極化狀態(tài)下膜的基本性質(zhì)。 方法：在大鼠脊髓新鮮薄組織片上，利用脊髓薄片膜片鉗全細胞記錄技術，記錄脊髓背角膠質(zhì)層神經(jīng)元接受超極化刺激后膜電位的變化情況。 結(jié)果：在電流鉗模式下，膜電位在超極化刺激結(jié)束后，從超極化電位水平恢復到靜息水平的過程中出現(xiàn)一個長時程的對抗回到靜息水平的現(xiàn)象超極化反跳，該超極化反跳幅值的最大值為（16.5±3.8） mV；在電壓鉗模式下，同時可以記錄到一個對應的長時程超極化激活的外向流，該外向流的最大幅值為：（45.0±2.1） pA，時程為：（475.0±0.8） ms. 該超極化反跳和超極化激活的外向流具有電壓依賴性，沒有時間依賴性。 結(jié)論：超極化刺激能引起大鼠脊髓膠質(zhì)層神經(jīng)元出現(xiàn)“超極化反跳”，該現(xiàn)象是神經(jīng)元在超極化狀態(tài)下的基本膜特性之一。

　　【關鍵詞】 反跳 脊髓 膠質(zhì)層 超極化 膜片鉗

　　0.引言

　　接受去極化刺激后能夠產(chǎn)生動作電位一直是判斷細胞具有興奮性的唯一標準。 然而大量的實驗發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元在接受超極化刺激后也能爆發(fā)動作電位。 “去極化反跳”現(xiàn)象對于神經(jīng)元的放電模式、節(jié)律活動和突觸可塑性具有重要的調(diào)節(jié)作用 ［1-2］。 該現(xiàn)象作為神經(jīng)元的基本膜特性已在許多不同腦區(qū)的神經(jīng)元上記錄到，包括丘腦、小腦、海馬和脊髓前角運動神經(jīng)元 ［3-4］。 說明神經(jīng)元在超極化狀態(tài)下還隱藏著一些尚未發(fā)現(xiàn)的性質(zhì)。 脊髓背角是接受來自傷害性感受器感覺纖維信息輸入的第一級中繼站。 膠質(zhì)層神經(jīng)元整合非傷害性和傷害性信息輸入，在感覺信息加工和轉(zhuǎn)換的可塑性中發(fā)揮著極其重要的作用［5］。 我們選擇脊髓背角作為研究對象，以探索神經(jīng)元在超極化狀態(tài)下的細胞膜特性。

　　1.材料和方法

　　1.1材料兩周齡新生SD大鼠，體質(zhì)量26～30 g，雌雄不限（第四軍醫(yī)大學實驗動物中心）。 戊巴比妥鈉，NaCl，KCl，KH2PO4，MgSO4，CaCl2，NaHCO3，Glucose和Potassium gluconate （天津市醫(yī)藥公司產(chǎn)品）；記錄電極（南京泉水實驗器材廠）；恒流泵（HL2型，上海滬西儀器廠）；振動切片機（vibratome 1000 plus，美國Vibratome 公司）；顯微鏡（BX51WI，日本Olympus公司）；放大器（Multiclamp 700B，美國Axon公司）；模數(shù)轉(zhuǎn)換器（Digidata 1322A，美國Axon公司）；滲透壓儀（Model 501，美國Precision system 公司）。

　　1.2方法

　　1.2.1脊髓薄片標本制作手術開始前準備混合氣飽和的冰浴人工腦脊液，用預先制備的瓊脂切出一個表面有條淺溝的瓊脂塊，將分裝的明膠置于40℃的恒溫條件下備用。 戊巴比妥鈉（30～40 mg/kg）麻醉動物，以角膜反射為指標，觀察動物的麻醉程度。 待動物麻醉后，將其俯臥置于冰板上。 沿脊柱中線切開皮膚，分離結(jié)締組織與肌肉。 從胸段至腰骶段行椎板切除術，暴露的脊髓立即用混合氣飽和的冰浴人工腦脊液覆蓋。 快速取出胸腰骶段脊髓，約2 cm長，移入冰浴人工腦脊液中，然后處死動物。 解剖顯微鏡下剝?nèi)ボ浖鼓ぃ粋?cè)的L4背根保留外，其余的背根與腹根盡皆剪除。 將帶背根的脊髓置于瓊脂塊的淺槽內(nèi)，將預熱的明膠滴在脊髓塊的胸腰段上對標本進行半包埋。 將瓊脂塊黏在切片機的載物臺上，在預先冰浴的人工腦脊液中進行切片。 首先背根保持自然下垂，在手術顯微鏡下調(diào)整刀片的位置，在靠近背根進入處切片，移去上段。 再用小毛筆將背根刷向上，刀片下降250～300 μm再次切片，即可得到帶背根的脊髓薄片。 將得到的脊髓標本移入混合氣飽和的人工腦脊液中，24～26℃下孵浴最少1 h，然后開始記錄。

　　1.2.2紅外線可視全細胞記錄實驗用Olympus正置顯微鏡配有5×物鏡（數(shù)字孔徑為0.10），40×浸水物鏡（數(shù)字孔徑為0.80），IR～DIC透鏡。 將脊髓切片移至記錄用灌流槽內(nèi)，用黏有平行細尼龍絲的U形鉑絲固定。 在記錄過程中，灌流速度保持在2～3 mL/min，溫度24～26℃。 灌流槽置于顯微鏡載物臺上，用5×物鏡觀察脊髓切片的分層，40×觀察細胞進行可視封接。 本實驗中，一般記錄距離切片表面80～100 μm深度的脊髓背角神經(jīng)元。 紅外線可視條件下，狀態(tài)良好的神經(jīng)元表面光滑、立體感強，以此為標準選擇要進行封接的細胞。 封接用微電極由薄壁有芯軟質(zhì)玻璃毛坯二次拉制而成，充灌電極內(nèi)液后電阻為8～12 MΩ。 用微操縱儀操縱記錄電極尖端接近所選神經(jīng)元。 在電極接近細胞的過程中，用1 mL注射器從后部給微電極內(nèi)施加正壓，以防止電極尖端在脊髓組織內(nèi)被堵塞。 微電極接觸細胞時，會觀察到細胞表面出現(xiàn)一個小凹，同時從封接測試窗口上顯示封接電阻變大。 撤去正壓，并施以一定的負壓吸引，同時將鉗制電壓調(diào)至-60 mV，如果封接電阻上升至GΩ水平，一般為2～8 GΩ，說明封接成功。 等待約1 min，從微電極尾端給予短促的負壓吸引，直至細胞膜被吸破，從而形成全細胞（wholecell）模式。

　　1.2.3數(shù)據(jù)采集與分析記錄的信號經(jīng)膜片鉗放大器放大與4 kHz的濾波，由數(shù)據(jù)采樣板進行A/D轉(zhuǎn)換，采樣頻率為10～20 kHz， 存貯在計算機內(nèi)。 分別在電壓鉗和電流鉗模式下輸入超極化方波刺激，記錄神經(jīng)元膜電位的反應情況和刺激誘導出來的電流。 所得數(shù)據(jù)以表示。［醫(yī)學教 育網(wǎng) 搜集整理］

　　2.結(jié)果

　　2.1細胞超極化電流刺激記錄電壓反應當細胞接受增幅為-10 pA超極化電流刺激后，在膜電位向靜息水平的復極過程中，再次出現(xiàn)明顯的超極化以對抗膜電位回復到靜息膜電位。 參考去極化反跳的定義［1］，我們把這個現(xiàn)象稱為“超極化反跳”，隨著刺激強度的增加，超極化反跳的幅值也在增大（圖1）。 幅值的測量為膜電位超極化的最大值與靜息膜電位之間的差值。 能引起超極化反跳的激活電流范圍為：-40～-70 pA. 大于-70 pA的刺激不會引起超極化反跳的幅值進一步增大。 超極化反跳幅值的最大值為（16.5±3.8） mV。

　　2.2細胞超極化電壓刺激記錄電流反應在同一神經(jīng)元上，增幅為-10 mV超極化電壓刺激能引起快激活、慢失活的外向流，該外向流具有電壓依賴性（圖2A）。 激活電壓范圍為：-60～-110 mV. 電流的最大值為（45±2.1）pA （n=17），時程為（475±0.8）ms （n=17）。 圖2B顯示的是該外向流的IV曲線，從曲線可以看出該外向流幅度隨膜電位的超級化而增大，其翻轉(zhuǎn)電位為-100.8 mV. 圖2C是該外向流的激活曲線，半數(shù)激活電壓為-102 mV.

　　2.3超極化反跳和超極化激活外向流的時間依賴性分別在電壓鉗和電流鉗模式下，固定輸入的電流和電壓刺激強度不變，而改變刺激的時間，分別以25 ms和5 ms的量遞增，發(fā)現(xiàn)超極化反跳和外向流的幅值均沒有發(fā)生變化（圖3）。 說明記錄到的超極化反跳和外向流不具有時間依賴性。

　　3.討論

　　以往認為神經(jīng)元在靜息狀態(tài)時，只會對引起膜電位去極化的刺激產(chǎn)生反應，而沒有注意到對于引起膜電位超極化刺激神經(jīng)元會有何反應，忽略了神經(jīng)元處于比靜息膜電位更超極化狀態(tài)下的反應性。 在本實驗中，脊髓背角神經(jīng)元在接受超極化刺激后，當膜電位處于-110 mV甚至更負的狀態(tài)下，神經(jīng)元在復極過程中出現(xiàn)了再次超極化的現(xiàn)象。 這提示神經(jīng)元在接受引起膜電位超極化的刺激后會對刺激發(fā)生反應，而且反應具有多樣性，包括產(chǎn)生去極化反跳，爆發(fā)動作電位和“超極化反跳”，發(fā)生再次超極化。 這兩個現(xiàn)象具有對應性：兩者的激活條件相同，出現(xiàn)的時間點相同，而且都具有電壓依賴性。 但是反跳和超極化反跳之間也存在許多不同點：表現(xiàn)方向截然相反。 反跳是膜電位去極化，而超極化反跳是膜電位超極化；反跳在神經(jīng)系統(tǒng)的不同區(qū)域均被記錄到，有關超極化反跳在此之前的研究報道較少，并且該現(xiàn)象在本實驗中的發(fā)生率也很低，不到10％。

　　我們參考“去極化反跳”的定義，結(jié)合實驗中記錄到該現(xiàn)象的特點給出了“超極化反跳”的定義。 Burdakov等［6］定義的超極化反跳是指細胞膜在接受超極化刺激后，膜電位的復極時程較長，并沒有出現(xiàn)本研究所記錄的復極過程中出現(xiàn)的二次超極化現(xiàn)象。 在本研究中，超極化反跳在大鼠脊髓背角膠質(zhì)層神經(jīng)元上表現(xiàn)為接受超極化刺激后，膜電位在復極前長時程的超極化現(xiàn)象，而且記錄到了一個對應的外向電流。 因此，我們認為用“超極化反跳”來定義這個現(xiàn)象更確切。 對膠質(zhì)層神經(jīng)元超極化狀態(tài)下細胞反應特性的研究能揭示感覺神經(jīng)元功能的復雜性，為進一步探索感覺信息傳遞機制提供實驗及理論依據(jù)。

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