【摘要】目的：觀察選擇性環(huán)氧化酶2抑制劑依托昔布對單側輸尿管梗阻大鼠腎臟病變的影響。

　　方法：將大鼠隨機分為單側輸尿管梗阻組，依托昔布治療組和對照組進行實驗，測定血肌酐、尿素氮和腎皮質NO含量，并用免疫組化法半定量測定腎組織TGFβ1和COX2的表達水平。 結果：單側輸尿管結扎術后3 wk，單側輸尿管梗阻組和用藥組大鼠腎臟均可見明顯病理改變與纖維化，血肌酐［（38.10±3.93，27.80±2.57） mL/min］、尿素氮［（9.18±0.03，8.14±0.03） mmol/L］和腎皮質NO含量［（6.01±0.17，4.47±0.12） mmol/L］均比對照組［（22.30±2.28） mL/min， （6.53±0.02） mmol/L， （1.65±0.11） mmol/L］顯著性升高，腎組織TGFβ1（2.41±0.19，1.38±0.13）和COX2（2.74±0.07，1.52±0.05）的表達水平顯著性上調。 用藥組與單側輸尿管梗阻組比較，病理改變與纖維化程度，血肌酐、尿素氮和腎皮質NO含量、腎組織TGFβ1和COX2的表達水平差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

　　結論：特異性COX2抑制劑依托昔布能減輕單側輸尿管梗阻大鼠腎臟病理損傷和纖維化改變。

　　【關鍵詞】 輸尿管梗阻 纖維化 環(huán)氧化酶2 依托昔布

　　0.引言

　　環(huán)氧化酶（cyclooxygenase， COX）包括 COX1和COX2兩種同工酶，目前認為是前列腺素代謝環(huán)節(jié)中的關鍵性限速酶，COX1參與正常生理過程，而COX2可介導病理改變［1］。 研究結果顯示，COX2大量生成在輸尿管梗阻所引發(fā)的腎小管間質纖維化過程中起重要作用［2］，并發(fā)現(xiàn)COX2在腎皮質的過度表達可能是腎內炎性細胞浸潤和聚集的起始或促進因素之一。 而臨床上用非甾體類抗炎藥（nonsteroid antiinflammatory drugs， NSAIDs）治療腎臟炎性疾病引起不良反應可能與NSAIDs在阻斷COX2催化的病理性前列腺素合成的同時，也阻斷了COX1催化的生理性前列腺素的合成有關。 為了探討通過選擇性地阻斷COX2的合成，避免NSAIDs的不良反應的有效途徑［3］，我們用單側輸尿管梗阻大鼠模型［4］，觀察腎組織中COX2和TGFβ1的改變及其在輸尿管梗阻所致腎損傷的發(fā)生發(fā)展中的作用，并觀察選擇性COX2抑制劑依托昔布（Etoricoxib）對梗阻性腎病發(fā)生發(fā)展的影響及對腎臟的保護作用，為治療相關腎臟損傷提供基礎。

　　1.材料和方法

　　1.1材料健康雄性SD大鼠30只，體質量180~220 g，中國醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，飼養(yǎng)環(huán)境保持通風，濕度55%，溫度22℃，晝夜燈光照明，定期消毒籠具。 依托昔布由北京欣經(jīng)科生物技術有限公司提供。 山羊抗大鼠COX2多克隆抗體、兔抗大鼠TGFβ1多克隆抗體為Santa Crutz公司產(chǎn)品。

　　1.2方法

　　1.2.1單側輸尿管梗阻模型動物平均分為對照組、單側輸尿管梗阻組和依托昔布治療組。 對照組除不結扎和剪斷輸尿管外，其余步驟同其它兩組。 治療組于術前24 h開始給予依托昔布，每日10 mg/kg溶于1 mL生理鹽水中灌胃，梗阻組僅以等量生理鹽水灌胃。 0.1 g/L水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉梗阻組和依托昔布治療組大鼠。 于背部左側縱形切開皮膚，鈍性分離肌肉，暴露左側腎臟，分離輸尿管，分別在緊貼腎門處及遠端結扎輸尿管，于兩結扎處之間剪斷，逐層縫合肌肉、皮膚，以碘伏消毒。 術后肌肉注射羅氏芬預防感染，每日1.5 mg/kg，連續(xù)3 d. 腎臟取材與保存：術后第3周，在采集血液標本后，手術取出大鼠左腎，剝離腎包膜，將腎臟沿縱軸剖開，取適量皮質組織作NO含量測定用，其余組織迅速保存在中性甲醛中以備組織學染色和免疫組織化學染色用。

　　1.2.2血液生化指標測定將術后第3周采集血液標本離心，取血清，在全自動生化分析儀上測定血肌酐與尿素氮。

　　1.2.3腎皮質NO含量測定取約0.5 g左腎組織，加入4 mL 4℃生理鹽水中，用玻璃勻漿器在冰水浴中研磨制成勻漿，4℃，1000 r/min，離心5 min，取上清液-20℃保存待測。 用硝酸還原酶法測定NO含量，按試劑盒檢測步驟，分別在空白管，標準管，測定管中滴加試劑，混勻，37℃水浴60 min，再次滴加試劑，充分旋渦混勻30 s，室溫靜置10 min， 4000 r/min離心10 min，取上清，分別加入顯色劑，混勻，室溫靜置10 min，蒸餾水調零，550 nm， 0.5 cm光徑比色測定各管吸光度值，NO含量（μmol/L）=［（樣品管吸光度-空白管吸光度）或（標準管吸光度-空白管吸光度）×標準值］÷樣品的蛋白濃度（g/L）。［醫(yī)學　教育網(wǎng) 搜集整理］

　　1.2.4Masson和免疫組織化學染色腎組織固定后石蠟包埋。 3 μm連續(xù)切片。 Masson染色：切片脫蠟水化，蒸餾水浸洗3次，每次3 min. 用Masson復合染液浸染10 min，冰醋酸沖洗。 磷鎢酸分化10 min，冰醋酸沖洗。 苯胺藍染色4 min，冰醋酸沖洗。 最后用蒸餾水浸洗2次，每次5 min. 干燥后用中性樹膠封片。 免疫組織化學染色：切片脫蠟水化后， 用PBS （pH 7.4， 10 mmol/L）浸洗。 內源性過氧化物酶阻斷劑室溫孵育，PBS洗后浸入檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0， 10 mmol/L），微波修復（2450 mHz， 800 W），加蒸餾水50 mL后冷卻。 PBS液浸洗；用正常山羊血清封閉，室溫孵育。 傾去血清，加入一抗（兔抗大鼠TGFβ1抗體，1∶400稀釋；山羊抗大鼠COX2抗體，1∶100稀釋），4℃冰箱過夜，復溫， PBS浸洗。 滴加生物素化抗兔或抗山羊二抗，室溫孵育。 PBS液浸洗，再滴加鏈霉菌抗生物素蛋白過氧化物酶，室溫孵育。 PBS液浸洗，顯色劑DAB顯色，自來水充分沖洗，蘇木素復染，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。 以正常兔或山羊血清代替一抗作陰性對照，免疫組化結果均為陰性。

　　1.2.5結果判定腎小管間質病變（腎小管擴張或萎縮、間質細胞浸潤及間質纖維化）程度的判定按Priraini法評分（0分：小管間質無病變；1分：輕度病變，范圍<20%；2分：中度病變，范圍20%~40%； 3分：重度，病變范圍>40%）。 每例切片記錄連續(xù)不重疊的20個低倍視野的數(shù)值，取平均值。 對TGFβ1和COX2的表達，根據(jù)著色范圍進行半定量分析（0分：無著色；0.5分：微量著色，面積占整個視野的10%以下；1分：輕度著色，著色面積占整個視野的10%~30%；2分：中度著色，著色面積占整個視野的30%~50%；3分：廣泛著色，著色面積占整個視野的50%以上）。 每例切片記錄20個連續(xù)不重疊的腎皮質間質高倍視野（盡量避開腎小球和大血管），取平均值。

　　統(tǒng)計學處理：實驗數(shù)據(jù)用x±s表示，用SPSS 10.0做統(tǒng)計分析， 所用統(tǒng)計方法為方差分析， P<0.05為檢驗水準。

　　2.結果

　　2.1腎臟大體形態(tài)與病理學所見梗阻組動物左側腎臟輸尿管結扎術后3 wk，腎臟明顯腫大，顏色變淺，剖面呈缺血狀，以腎皮質為重。 腎盂、腎盞擴張明顯，充滿尿液，腎實質變薄，皮髓質界限模糊不清。 經(jīng)Masson染色后對照組比較，腎間質明顯增寬，其中有大量炎癥細胞浸潤，間質纖維化明顯。 與治療組比較，依托昔布能夠明顯地改善單側輸尿管梗阻時的病理改變，鏡下可見間質內炎癥細胞減少，纖維化明顯減輕。

　　2.2生化指標輸尿管結扎術后3 wk，梗阻組和治療組尿素氮與血肌酐定量均比對照組升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），表明梗阻性腎的損傷。 而治療組與梗阻組之間尿素氮與血肌酐定量差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明依托昔布對腎損傷有保護作用（表1）。

　　2.3腎組織勻漿NO含量變化術后3 wk， 三組比較， 腎皮質勻漿NO2-/NO3-含量變化非常顯著， 治療組與梗阻組比較， 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05， 表1）。 表明NO參與了梗阻性腎損傷的發(fā)生發(fā)展過程， 而依托昔布可以降低NO的合成。 表1尿素氮、血肌酐、NO含量及TGFβ1 COX2半定量計分比較

　　2.4腎小管間質TGFβ1的表達術后3 wk，三組比較，腎小管間質TGFβ1表達的免疫組織化學染色半定量計分差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 梗阻組與治療組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，表1）。 表明TGFβ1參與了梗阻性腎損傷的發(fā)生發(fā)展過程，而依托昔布可以降低TGFβ1的生成。［醫(yī)　學教育網(wǎng) 搜　集整理］

　　2.5腎小管間質COX2的表達治療組和梗阻組與對照組比較COX2表達明顯增加，而治療組和梗阻組之間差異亦有統(tǒng)計學意義（P<0.01，表1）。 表明COX2參與了梗阻性腎損傷的發(fā)生發(fā)展過程，而依托昔布可以減少COX2的生成。

　　3.討論

　　本研究中，單側輸尿管梗阻大鼠在其梗阻3 wk后，可見腎間質增寬，炎癥細胞浸潤，部分腎小管萎縮，腎小管間質明顯纖維化，血肌酐與尿素氮水平上升，表明腎功能受損。 腎皮質勻漿NO含量升高，腎小管間質TGFβ1的表達和COX2的表達上調，提示二者參與了腎損傷的發(fā)生發(fā)展。 單側輸尿管梗阻后使用依托昔布的大鼠，腎功能損傷和腎小管間質纖維化程度明顯減輕。 據(jù)此我們推論，依托昔布對于大鼠單側輸尿管梗阻病變具有保護作用。

　　目前已經(jīng)開發(fā)出多種選擇性COX2抑制劑（可分為第一代和第二代），臨床上主要用于治療風濕性關節(jié)炎和骨關節(jié)炎［5-6］，然而有關選擇性抑制COX2對各種腎臟疾病影響的研究較少。 有關學者［7-8］用大鼠腎大部切除2 wk的模型研究發(fā)現(xiàn)，腎臟致密斑及皮質升支粗段的COX2表達顯著增加，而COX1無明顯變化；使用COX2抑制劑可以有效減少前列腺素的生成，延緩腎小球硬化的病程進展。 而用COX1抑制劑卻無效。 有關學者［9］提出，COX2在單側輸尿管梗阻小鼠腎皮質的過度表達很可能是腎內炎性細胞浸潤和積聚的起始或促進因素之一，但迄今尚未見COX2與腎小管間質纖維化的相關性研究報道。 本研究表明，COX2參與了單側輸尿管梗阻后腎損傷發(fā)生和發(fā)展的病理過程，并在大鼠梗阻性腎損傷的腎間質纖維化的過程中有重要作用。 同時發(fā)現(xiàn)，第二代高特異性COX2抑制劑依托昔布能夠減輕腎功能損傷和腎組織纖維化進展，抑制NO活性，下調TGFβ1和COX2的表達，從多方面發(fā)揮對梗阻性腎損傷的保護作用。

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