【摘要】目的：復(fù)制家兔膽固醇結(jié)石模型，檢測模型家兔肝組織固醇攜帶蛋白2（SCP2） mRNA的表達(dá)。 方法：健康北京大耳白家兔16只，隨機(jī)分為2組，每組8只：對照組喂普通飲食，模型組喂高膽固醇飲食（含12 g/kg膽固醇）。 4 wk時(shí)剖殺動物，采用半定量RTPCR檢測SCP2 mRNA在家兔肝組織的表達(dá)。 結(jié)果：對照組無結(jié)石形成；模型組成石率達(dá)87.5%. 與對照組相比，模型組動物肝組織SCP2 mRNA表達(dá)升高（0.79±0.17 vs 0.44±0.07，P<0.05）。 結(jié)論：高膽固醇膳食致家兔膽囊結(jié)石形成時(shí)肝組織SCP2 mRNA表達(dá)升高。

　　【關(guān)鍵詞】 固醇攜帶蛋白2 成石指數(shù) 膽石模型

　　0.引言

　　膽囊膽固醇結(jié)石的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。 目前認(rèn)為肝臟膽固醇代謝紊亂，產(chǎn)生成石性膽汁，是膽囊膽固醇結(jié)石形成的首要和重要原因。 固醇攜帶蛋白2（sterol carrier protien2， SCP2）又稱非特異性轉(zhuǎn)脂蛋白（nonspecific lipid transfer protein，nsLTP）是一種Mr為13.0×103～14.8×103的可溶性堿性蛋白，存在于過氧化物酶體，線粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和胞質(zhì)中，肝臟中含量最高。 它一方面作為膽固醇和磷脂代謝的調(diào)節(jié)因子［1-2］，參與膽固醇的生物合成和膽固醇向膽汁酸、膽固醇酯及類固醇激素的轉(zhuǎn)化；另一方面作為膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)器，參與細(xì)胞內(nèi)、質(zhì)膜間膽固醇的運(yùn)輸，并能將肝臟新合成的膽固醇直接從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)快速轉(zhuǎn)運(yùn)至膽汁，因此在膽固醇結(jié)石形成中起顯著作用［3］。 我們以往的研究發(fā)現(xiàn)，SCP2在膽囊膽固醇結(jié)石患者肝組織表達(dá)升高［4］。 為進(jìn)一步研究SCP2表達(dá)與膽固醇結(jié)石形成的關(guān)系，我們采用高膽固醇膳食誘發(fā)家兔膽囊膽固醇結(jié)石模型，檢測了家兔血清脂質(zhì)成分、膽囊膽汁成分及成石指數(shù)（lithogenic index，LI）和肝組織SCP2 mRNA表達(dá)，以期闡明SCP2基因轉(zhuǎn)錄在膽固醇結(jié)石形成中的作用。

　　1.材料和方法

　　1.1材料健康北京大耳白家兔16只，體質(zhì)量1.6～2.2 kg，3～4月齡，雌雄不拘，由天津市實(shí)驗(yàn)動物中心提供。 膽固醇干粉系天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所產(chǎn)品，由天津市實(shí)驗(yàn)動物中心加工成與普通顆粒飼料外觀相同的含12 g/kg膽固醇的顆粒飼料。 血脂測定試劑盒和膽汁膽固醇測定試劑盒購自北京中生北控生物科技股份有限公司。 膽汁酸測定試劑盒購自寧波市慈城生化試劑廠。 磷脂測定試劑盒購自北京利德曼生化技術(shù)有限公司。 膽汁LI通過Carey表計(jì)算［5］。 總RNA提取試劑盒購自美國Promega公司。 RTPCR試劑盒購自寶生物工程有限公司。 引物由上海生工生物工程有限公司合成。

　　1.2方法

　　1.2.1動物分組家兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1 wk后，隨機(jī)分為2組，每組8只：對照組喂普通顆粒飼料；模型組喂含12 g/kg膽固醇的顆粒飼料。 動物自由進(jìn)食飲水，分籠飼養(yǎng)4 wk. 剖殺前禁食水12 h，200 g/L烏拉坦（1 g/kg）耳緣靜脈注入麻醉，碘伏消毒后開腹，迅速取肝組織置-80℃保存；取血5 mL；距膽囊 0.5 cm處結(jié)扎膽囊管并切斷，完整分離膽囊，連同膽囊內(nèi)膽汁一起置室溫備用。［醫(yī)學(xué)教　育網(wǎng) 搜集整理］

　　1.2.2RNA提取和RTPCR肝組織總RNA提取參見試劑盒說明。 家兔SCP2上游引物： 5′GCCAACGAACTCCTCACTTAT3′，下游引物： 5′TTGCCATTCTTCACATCTACCA3′，擴(kuò)增片段517 bp；內(nèi)參選用βactin：上游引物 5′GCC ATG TAC GTA GCC ATC CA 3′，下游引物 5′GAA CCG CTC ATT GCC GAT AG 3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為375 bp. 逆轉(zhuǎn)錄－擴(kuò)增參數(shù)：50℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，94℃，2 min終止反應(yīng)。 94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，24個(gè)循環(huán)，循環(huán)后72℃延伸7 min. 5 μL PCR產(chǎn)物20 g/L瓊脂糖電泳。 數(shù)字凝膠自動分析系統(tǒng)測定內(nèi)參和目的基因擴(kuò)增電泳帶的光密度值。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：計(jì)量數(shù)據(jù)以x±s表示，兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，率的比較采用Fisher確切概率法，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

　　2.結(jié)果

　　2.1膽囊結(jié)石成石情況兩組動物生長良好。 對照組動物肝臟有光澤，質(zhì)軟，膽囊外觀正常。 模型組動物脂肪肝表現(xiàn)：肝臟色澤變黃、變白，質(zhì)地變硬；膽囊脹大，張力增高。 剖開膽囊，肉眼觀察膽汁內(nèi)棕黑色、成型顆粒，米粒大?。?0倍光鏡下見致密大團(tuán)塊膽固醇結(jié)晶判定為有結(jié)石，膽囊膽汁內(nèi)未見有形成分判定為無結(jié)石。 對照組無結(jié)石形成；模型組8只動物高膽固醇膳食4 wk后有7只形成結(jié)石，成石率達(dá)87.5%，兩組成石率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

　　2.2血脂變化與對照組相比，模型組動物血清TG，CHO，HDLc和LDLc均有不同程度的升高，其中CHO，HDLc和LDLc的組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。 將血脂逐項(xiàng)引入相關(guān)分析，僅發(fā)現(xiàn)HDLc與成石指數(shù)LI呈負(fù)相關(guān)（Pearson相關(guān)系數(shù)r=-0.501，P=0.015）。 將兩組動物血清CHO的構(gòu)成作了比較，發(fā)現(xiàn)對照組血清CHO以HDLc為主（69.2%），而模型組CHO中HDLc 僅31.6%.

　　2.3膽囊膽汁成分測定結(jié)果和LI模型組動物膽囊膽汁膽固醇含量升高，膽汁酸含量降低，分別與對照組相比，差異有顯著性意義（P<0.01，表2）。 模型組LI較對照組升高（P<0.05，表2）。表1膽結(jié)石兔血血脂變化表2膽結(jié)石兔膽囊膽汁成分和LI

　　2.4肝組織SCP2 mRNA的檢測模型組SCP2 mRNA表達(dá)較對照組升高（0.79±0.17比0.44±0.07，P<0.05）有顯著性意義。

　　3.討論

　　高膽固醇膳食致兔膽囊結(jié)石時(shí)脂代謝變化的特點(diǎn)之一是膽固醇在血液中大量堆積。 我們發(fā)現(xiàn)模型組動物血清TC，HDLc和LDLc較對照組均升高，對照組HDLc占TC的69.2%，LDLc占TC的6.6%；而模型組動物HDLc雖較對照組升高，但僅占TC的31.6%，LDLc卻占TC的42.2%. 由此可見模型組家兔血中膽固醇的堆積的同時(shí)，還存在構(gòu)成比異常，主要表現(xiàn)為LDLc的升高，而HDLc的含量相對減少，使得HDL逆向轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇的作用大大減弱。

　　我們發(fā)現(xiàn)HDLc與LI之間存在負(fù)相關(guān)，提示高水平的HDLc可阻止膽石的發(fā)生，這可能也與肝臟清除超負(fù)荷的膽固醇時(shí)優(yōu)先利用HDLc合成膽汁酸提高了膽汁中膽汁酸的含量有關(guān)，但由于高膽固醇膳食時(shí)膽固醇直接和間接排泌入膽汁的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過膽汁酸，最終還是導(dǎo)致膽汁膽固醇過飽和，結(jié)石形成。

　　體內(nèi)膽固醇主要通過合成膽汁酸和直接分泌膽固醇入膽汁再排出體外，當(dāng)膽固醇向膽汁酸合成的排除途徑減弱后，則可能也只有通過排出更多的膽固醇入膽汁的形式排出體外，這必然造成膽汁中膽固醇過飽和、析出乃至結(jié)石形成。 在膽汁中膽固醇溶解于由膽汁酸、磷脂所構(gòu)成的微團(tuán)（micelle）中，LI是指在一定的微團(tuán)中實(shí)際溶解的膽固醇量與在同一體系中所能溶解的膽固醇最大量的比值，正常膽汁LI小于1，膽固醇患者膽汁LI大于1. 模型組LI較對照組升高，提示高膽固醇膳食誘發(fā)膽囊結(jié)石形成時(shí)可通過上調(diào)SCP2 mRNA表達(dá)、增加膽固醇向膽汁的排泌和減少膽汁酸的生成兩條途徑來提高膽汁LI，促進(jìn)膽囊結(jié)石的形成。

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