摘要】  　　目的：為了尋找腫瘤特異凋亡蛋白，克隆雞法氏囊組織中雞貧血病毒Apoptin蛋白的編碼基因并進(jìn)行序列分析。 方法：根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫(kù)資料設(shè)計(jì)合成引物，以成雞法氏囊組織中提取的DNA作模板，通過PCR獲得了特異擴(kuò)增產(chǎn)物，將其插入到pGEMTeasy載體并轉(zhuǎn)染感受態(tài)E.coliDH5α菌株，提取質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切鑒定后，使用DNA測(cè)序儀測(cè)定插入片段的DNA序列。 使用DNAsis分析軟件分析所克隆的DNA序列及其編碼蛋白質(zhì)，并與數(shù)據(jù)庫(kù)中Apoptin蛋白的編碼基因相比較。 結(jié)果：序列分析表明，成功地克隆了雞貧血病毒的Apoptin基因，同基因數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)資料比較發(fā)現(xiàn)與山東報(bào)道的Apoptin基因（GenBank AY171617）的核酸序列一致，同雞貧血病毒全基因序列中的Apoptin序列（GenBank AF 313470）有6個(gè)核酸差異。 結(jié)論：Apoptin編碼基因的克隆為特異誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡治療腫瘤奠定了基礎(chǔ)。

　　【關(guān)鍵詞】  雞貧血病毒 凋亡素 克隆 測(cè)序

　　0.引言

　　雞貧血病毒（chicken anemia virus， CAV）是由DanenVan Oorschot等［1］在1979年發(fā)現(xiàn)并能引起雛雞貧血死亡的一種環(huán)狀病毒。CAV基因組長(zhǎng)度約2.3 kb［2］，能分別編碼VP1，VP2和VP3三種蛋白質(zhì)。 其中VP3蛋白是功能蛋白質(zhì)，由121個(gè)氨基酸組成，它包含兩個(gè)富含脯氨酸的序列和兩個(gè)帶正電的區(qū)域，具有誘導(dǎo)被感染雞血細(xì)胞凋亡的活性，是雞貧血病毒的主要致病因子，根據(jù)此特性將該蛋白命名為凋亡素（Apoptin）［3］。 在Apoptin誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用機(jī)制研究方面已取得較大進(jìn)展［4］， Apoptin能特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞調(diào)亡，其發(fā)生作用不依賴p53基因，而且不被Bcl2過表達(dá)所抑制，因此這種Apoptin可能成為一種很有前途的能選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞發(fā)生凋亡的藥物。

　　本研究旨在從自然生長(zhǎng)的家雞法氏囊中分離、提取CAV DNA，通過PCR方法擴(kuò)增CAV的Apoptin編碼基因，將其插入克隆載體PGEMT中，使用雙脫氧終止法測(cè)定插入片段的DNA序列，同Genbank的數(shù)據(jù)庫(kù)比較證實(shí)獲得了CAV的Apoptin編碼基因克隆，為研究Apoptin治療腫瘤奠定了基礎(chǔ)。

　　1.材料和方法

　　1.1材料4只低體質(zhì)量（<1400 g），低產(chǎn)卵的3月齡雌雞（購(gòu)于西安市郊區(qū)某雞場(chǎng)）；PGEMT質(zhì)粒、E.coliDH5α（西安市華廣生物工程有限公司實(shí)驗(yàn)室提供）。 耐熱的TaqDNA聚合酶、各種限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、蛋白酶K， DNA Mr標(biāo)準(zhǔn)，華美生物公司；E.coliDH5α受體菌，華廣生物工程公司。

　　1.2方法

　　1.2.1病毒DNA提取將雞頸靜脈放血處死，立即分離法氏囊，置液態(tài)氮冷凍保存；取100 mg冷凍組織，在1 mL的勻漿緩沖液（50 mmol/L TrisHCl， 100 mmol/L NaCl， 2 mmol/L EDTA， pH 8.0）中制備組織勻漿；取500 μL勻漿加入SDS和蛋白酶K，使其終濃度分別為1和200 mg/L，37℃溫育120 min消化組織蛋白，消化后加入等體積的酚和氯仿/異戊醇各抽提一次，收集上清液加入RNase，37℃溫育60 min，再次用酚和氯仿/異戊醇各抽提，加入二倍無水乙醇沉淀，收集沉淀使用700 mL/L乙醇洗滌后干燥，使用100 μL TE緩沖液溶解備用。

　　1.2.2引物的設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank發(fā)表的CAV基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物。     正向引物5′CGG CCG GCG TGG GAT GAA CGA TCT CCA AGA AGA TAC3′， 　　反向引物5′CAA GCT TCA GTC TTA TAC GCC TTC TTG CGG TTC3′。 粗斜體表示在正向引物和反向引物的5′端加入的Nae I 和Hind III酶切位點(diǎn)，在正向引物和反向引物中分別加入了CG和C保護(hù)堿基。 為了作Apoptin同相關(guān)蛋白的融合表達(dá)在反向引物3′端刪除了終止子。

　　1.2.3PCR反應(yīng)將上述目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)參數(shù)為：94℃ 5 min預(yù)變性， 94℃ 60  s， 60℃ 60 s， 72℃ 90 s，循環(huán)30次后，72℃延長(zhǎng)5 min；PCR產(chǎn)物的鑒定與回收及同線性載體pGEMT連接、受體菌的轉(zhuǎn)化按常規(guī)分子生物學(xué)方法進(jìn)行。

　　1.2.4陽性重組子的篩選與鑒定轉(zhuǎn)化菌涂在含氨芐青霉素的加入X gal和IPGT的LB平板上，挑取白色菌落，擴(kuò)增后提取質(zhì)粒，EcoR I酶切后，瓊脂糖凝膠電泳。

　　1.2.5序列比較分析選取陽性重組克隆，由上?；倒編椭鷾y(cè)定插入片段序列。 插入片段同CAV Apoptin基因序列的一致性和編碼蛋白質(zhì)的分析使用DNAsis 2.5軟件完成。［醫(yī) 學(xué)教育網(wǎng) 搜集整理］

　　2.結(jié)果

　　2.1PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（366 bp）與目的片斷相吻合（圖1）。

　　2.2重組質(zhì)粒pGEMT/Apoptin的酶切鑒定重組質(zhì)粒pGEMT/Apoptin經(jīng)EcoRⅠ酶切瓊脂糖凝膠電泳得到2659 bp和約400 bp（393 bp）的兩片段， 后者與目的片斷大小一致（圖2）。

　　2.3重組pGEMT/Apoptin質(zhì)粒中的Apoptin基因測(cè)序?qū)Λ@得的重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列測(cè)定，測(cè)定的結(jié)果表明插入片段與設(shè)計(jì)片段序列完全一致，無堿基突變和讀碼框移位。

　　2.4克隆Apoptin編碼基因分析同GenBank AF 313470比較，本研究克隆的CAV Apoptin基因序列有6個(gè)核酸變異；同文獻(xiàn)報(bào)道的Apoptin基因序列AY171617一致。

　　3.討論

　　Apoptin是CAV的VP3蛋白基因編碼的一種蛋白質(zhì)，這種蛋白能特異性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞調(diào)亡，因此人們也稱其為凋亡素-Apoptin，其發(fā)生作用不依賴p53基因，也不能被Bcl2過表達(dá)所抑制，有可能成為研究腫瘤細(xì)胞凋亡和抗腫瘤藥物很有用的一個(gè)靶分子。［醫(yī)學(xué)教育網(wǎng) 搜 集整理］

　　為了證實(shí)克隆的基因是否為Apoptin基因，將其與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)基因進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄的46株CAV的VP3基因的同源性至少為98%，證實(shí)了克隆的DNA片段確為Apoptin基因。 同時(shí)將克隆的VP3基因ORF推導(dǎo)得到的蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)蛋白質(zhì)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的29株CAV的凋亡素氨基酸序列的同源性至少為82%. CAV是一種比較保守的病毒［5］，目前僅發(fā)現(xiàn)一種血清型。 凋亡素分子的118位氨基酸，所有報(bào)道的序列中幾乎一半為Cys，一半為Arg. 實(shí)驗(yàn)證明，這一變化對(duì)凋亡素活性影響似乎比較大，當(dāng)這個(gè)位點(diǎn)的Arg變成Cys時(shí)，CAV在傳代細(xì)胞中的傳代效率降低，而且將降低凋亡素的核定位能力，表現(xiàn)為存留在胞質(zhì)中的凋亡素量將超過細(xì)胞核的量，進(jìn)而將降低其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性。 我們克隆的VP3基因編碼的蛋白質(zhì)是118 Arg，因此可能具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的活性。 凋亡素可能是通過一種與大多數(shù)功能蛋白質(zhì)不同的作用機(jī)制來發(fā)揮其誘發(fā)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡作用的，凋亡素在發(fā)揮功能時(shí)可能并不以單體的形式存在，而是與其他成分結(jié)合，或與自身成分形成異源或同源多聚體來發(fā)揮其功能。 Leliveld等［6］將麥芽糖結(jié)合蛋白（maltose bindingprotein， MBP）與凋亡素分子連接，構(gòu)建了一個(gè)可溶性的重組凋亡素蛋白融合體（MBPApoptin），經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)證明MBPApoptin是一個(gè)由30～40個(gè)亞基組成的穩(wěn)定、均一在體內(nèi)有活性的球形多聚體復(fù)合物；Zhang等［7］通過顯微注射手段將MBPApoptin分別注射到腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞中，結(jié)果證實(shí)MBPApoptin在腫瘤細(xì)胞中具有顯著的效價(jià)和特異性，而在正常細(xì)胞中細(xì)胞抗原表位被保護(hù)，MBPApoptin匯集成高級(jí)聚集體，最終在細(xì)胞質(zhì)中被蛋白酶降解而消失［8］。 由于VP3基因編碼的凋亡素蛋白Apoptin具有很高選擇性，這些特性進(jìn)一步增強(qiáng)了凋亡素作為抗腫瘤藥物的安全性。 從而有望解決腫瘤治療中高效性和特異性難于統(tǒng)一及易產(chǎn)生耐藥性等難題。 Apoptin將是一種非常有前景的抗腫瘤制劑，它的開發(fā)利用必將會(huì)產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

　　【參考文獻(xiàn)】［1］ DanenVan Oorschot AA， van Der Eb AJ， Noteborn MH. The chicken anemia virusderived protein apoptin requires activation of caspases for induction of apoptosis in human tumor cells［J］。 J Virol， 2000， 74（15）： 7072-7078.

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