【摘要】反向遺傳操作技術(shù)（reverse genetics， RG）是近年來(lái)比較熱門(mén)的一門(mén)技術(shù)，該技術(shù)可以在DNA水平上對(duì)病毒基因組進(jìn)行各種修飾或改造，然后通過(guò)拯救病毒的表型變化來(lái)判斷這些基因操作的效果，從而可以對(duì)病毒基因組表達(dá)調(diào)控機(jī)制、病毒致病的分子機(jī)理等進(jìn)行研究。 我們通過(guò)對(duì)近年來(lái)國(guó)外有關(guān)文獻(xiàn)的回顧，希望能夠正確看待病毒拯救技術(shù)的利弊，注意生物安全性，希望能夠?yàn)榉乐慰赡馨l(fā)生的流感病毒流散和傳播提供新的思路。

　　【關(guān)鍵詞】  流感病毒 疫苗 反向遺傳技術(shù)

　　0.引言

　　20 世紀(jì)人類(lèi)歷史上發(fā)生過(guò)4 次流感的大流行，對(duì)人類(lèi)健康和生命安全都造成了嚴(yán)重危害。 最近，H5N1高致病性禽流感病毒全世界范圍內(nèi)的肆虐，又引起了世人廣泛的恐慌。 疫苗的應(yīng)用是主要控制和預(yù)防這種疾病的手段。但是因?yàn)榭乖坪涂乖D(zhuǎn)變，流感病毒的抗原不斷發(fā)生變異，這就需要我們安全、穩(wěn)定、快速的再形成新的疫苗株。 利用反向遺傳操作技術(shù)，使產(chǎn)生流感病毒完全從克隆的質(zhì)粒DNA通過(guò)8質(zhì)粒系統(tǒng)，或者改進(jìn)的少于8質(zhì)粒系統(tǒng)［1］，再共轉(zhuǎn)染合適的細(xì)胞從而快速的得到基因修飾的疫苗候選株。 流感防治的前景在于反向遺傳操作技術(shù)在研制更有效的流感疫苗中的應(yīng)用，及對(duì)其基因功能的研究。

　　1.禽流感病毒與人流感病毒的關(guān)系及感染人的機(jī)制

　　禽流感病毒和人流感病毒都屬于流感病毒，只是因?yàn)椴《靖腥镜乃拗鲗?zhuān)一性不同而作相應(yīng)的命名，A， B， C這3型流感病毒中，A型可感染人和禽類(lèi)，感染禽類(lèi)的稱(chēng)為禽流感病毒，感染人的稱(chēng)為人流感病毒，而影響宿主專(zhuān)一性的主要因素是病毒的M基因、NP基因和PB2基因等。 禽流感病毒感染人之前，一般需先通過(guò)中間宿主完成適應(yīng)性轉(zhuǎn)變或?qū)崿F(xiàn)抗原轉(zhuǎn)變，但目前已報(bào)道有三類(lèi)禽流感病毒毒株H5N1， H7N7和H9N2能直接感染人［2］。 其中，只有H5N1可使人發(fā)生嚴(yán)重疾病，另外兩種病毒的感染不會(huì)造成人的嚴(yán)重疾?。?］。 禽流感感染人類(lèi)機(jī)制多數(shù)學(xué)者認(rèn)為， 一方面與禽流感結(jié)合受體的改變有關(guān)，使病毒HA蛋白基因發(fā)生突變，主要是從NeuAca2、3Gal受體結(jié)合型向NeuAca2， 6Gal受體結(jié)合型改變； 這種受體結(jié)合的改變是禽流感感染人類(lèi)的關(guān)鍵步驟； 另一方面，與禽流感自身核蛋白結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)，像H3亞型的禽流感226位的谷胺酰氨突變成亮氨酸后和人類(lèi)受體的結(jié)合能力就將增強(qiáng)［4］。 流感病毒感染人的體細(xì)胞后必須進(jìn)行有效復(fù)制， 才能對(duì)人體造成損害。 禽流感不能在人的體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行有效復(fù)制， 這主要是與病毒的核蛋白（PB1， PB2， PA， NP） 有關(guān)， 其中PB2 的組成起決定性作用。

　　由于流感病毒基因組是8節(jié)段負(fù)義的RNA，其基因組不具有感染性，各個(gè)RNA 片段必須與聚合酶蛋白（PB2， PB1， PA）及核蛋白（NP）結(jié)合在一起形成核糖核蛋白復(fù)合物RNPs才有活性。 病毒感染的第一步是與宿主細(xì)胞表面的特異性受體HA結(jié)合，通過(guò)融膜進(jìn)入細(xì)胞后，釋放出RNPs，RNPs進(jìn)入細(xì)胞核才開(kāi)始病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，每個(gè)RNA片段單獨(dú)組成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，轉(zhuǎn)錄出mRNA和互補(bǔ)RNA（cRNA），mRNA翻譯合成病毒蛋白，cRNA復(fù)制生成病毒負(fù)鏈子代RNA，進(jìn)而在細(xì)胞漿中組裝成完整的病毒粒子。  HA 在病毒吸附及穿膜過(guò)程中以及決定病毒的致病力方面也均起著相當(dāng)關(guān)鍵的作用，它能否被裂解為HA1和HA2 兩部分是病毒感染細(xì)胞的先決條件，也是決定病毒致病力的主要因素。 通過(guò)核苷酸序列分析表明，毒力突變株要么在HA 裂解位點(diǎn)附近丟失糖基化位點(diǎn)，要么在HA 裂解位點(diǎn)后面獲得一個(gè)額外的精氨酸。 如HA易于被切割，則毒株具有較高的致病性；反之，則致病力較低［5］。 研究表明HA 可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，是禽流感中最重要的保護(hù)性抗原，而且還可以刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞反應(yīng)。 HA 切割位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)是影響其切割性的主要原因，包括位點(diǎn)插入處有多個(gè)堿性氨基酸，還有切割位點(diǎn)附近糖基化位點(diǎn)的缺失等，均能使HA 對(duì)蛋白切割酶的敏感性增強(qiáng)，從而使病毒致病性提高。 人和禽H5NI流感病毒相比，人H5N1流感病毒的NA柄有19個(gè)，從而導(dǎo)致酶活力下降，這種短莖特點(diǎn)是其病毒毒力的決定因素之一［6］。   香港H5N l 毒株中PB2 的第627 位氨基酸產(chǎn)生了由賴(lài)氨酸（Lys） 型向谷氨酸（Glu） 型的轉(zhuǎn)化，促使病毒核蛋白的合成， 使病毒在體內(nèi)能有效地進(jìn)行復(fù)制， 導(dǎo)致這種轉(zhuǎn)化的機(jī)制可能與組成PB2 的第199 位氨基酸絲氨酸（Ser） 的突變有關(guān)［7］。  另外，在病毒的進(jìn)化過(guò)程中，同型A IV 在不同進(jìn)化種系間發(fā)生了基因重組。 這種突變和重組也是決定病毒毒力的因素之一。［醫(yī)學(xué) 教育網(wǎng) 搜集整理］

　　2.以質(zhì)粒為基礎(chǔ)的反向遺傳操作技術(shù)在流感中的應(yīng)用及其發(fā)展

　　反向遺傳學(xué)是近年來(lái)比較熱門(mén)的一門(mén)技術(shù)，自1978年第1例RNA病毒Qβ噬菌體的成功拯救以來(lái)，各類(lèi)RNA病毒的分子生物學(xué)研究取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，這主要?dú)w功于各種RNA病毒反向遺傳系統(tǒng)的建立和發(fā)展。 流感病毒是負(fù)鏈RNA病毒，基因組是支離破碎的。 200601據(jù)《自然》雜志報(bào)道一項(xiàng)電子顯微鏡研究顯示：每個(gè)正在發(fā)育的流感病毒粒子含有一個(gè)遺傳材料組成的中心桿，這個(gè)中心桿被外圍的桿所包圍。 這種高水平的組織可能是決定該病毒感染周期的一個(gè)因素，而感染周期可能是新的抗病毒藥物的一個(gè)作用目標(biāo)。 而且更主要的是明確了流感內(nèi)部的結(jié)構(gòu)將加速發(fā)展基因遞送和表達(dá)的效率［7］，從而也為提高病毒拯救效率奠定理論基礎(chǔ)。 最初研究人員通過(guò)純化RNPs蛋白，來(lái)獲得流感病毒；1989年，研究人員通過(guò)輔助病毒，獲得了流感病毒；1999年，F(xiàn)odor首次通過(guò)12質(zhì)粒系統(tǒng)拯救出流感病毒； 2005年Hoffmann等［8］建立了使用雙向轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體的8質(zhì)粒系統(tǒng)，在同一個(gè)模板（載體上）實(shí)現(xiàn)vRNA的轉(zhuǎn)錄和病毒蛋白的表達(dá)。 在這種表達(dá)載體中，把編碼vRNA的cDNA正向克隆至polⅡ啟動(dòng)子（從人巨細(xì)胞瘤病毒CMV啟動(dòng)子衍化而來(lái)）和終止序列（牛生長(zhǎng)激素poly（A）信號(hào)aⅡBGH）之間，在此表達(dá)盒之間還反向插入了人polⅠ啟動(dòng)子（PⅠh）和鼠polⅠ終止序列（tⅠ）。 8個(gè)基因片段cDNA分別克隆后轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，在同一個(gè)模板上由polⅠ控制合成負(fù)鏈vRNA，由polⅡ控制合成正鏈mRNA并表達(dá)蛋白質(zhì)。 但由于使用同一個(gè)模板獲得蛋白表達(dá)和vRNA合成，又會(huì)減小系統(tǒng)的“彈性”，例如，在病毒蛋白和基因傳遞的研究中，缺少一個(gè)或多個(gè)片段或者某個(gè)（些）片段中存在致死性突變時(shí)，就不可能產(chǎn)生病毒樣粒子（viruslike particles，VLP）。 然而，適合于生產(chǎn)人類(lèi)疫苗的細(xì)胞系（如Vero細(xì)胞）不能夠進(jìn)行高效轉(zhuǎn)染。 為了解決這些問(wèn)題，Neumann創(chuàng)建了一套少于以PHW2000為載體的經(jīng)典的8個(gè)質(zhì)粒反基因系統(tǒng)。 在此系統(tǒng)中減少了用于產(chǎn)生病毒的質(zhì)粒。 八個(gè)用于病毒合成的RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄盒與一個(gè)允許插入大片段外源基因的的PTM克隆載體結(jié)合。 同樣，兩個(gè)編碼紅細(xì)胞凝集素和神經(jīng)氨酸苷酶片段的載體盒和六個(gè)編碼其他蛋白質(zhì)的載體盒結(jié)合。 另外，將用于表達(dá)聚合酶亞基的三個(gè)RNA聚合酶II 載體盒和編碼NP蛋白載體盒結(jié)合。 通過(guò)分別組合這些載體盒，顯著降低了病毒繁殖所需要的質(zhì)粒數(shù)量，分別形成了3， 4質(zhì)粒的系統(tǒng)。 生產(chǎn)甲型流感病毒的效率較傳統(tǒng)的12質(zhì)粒系統(tǒng)更高［1］，并且在新一代的細(xì)胞培養(yǎng)流感疫苗，此新系統(tǒng)更適合于生產(chǎn)流感病毒疫苗。 A型流感病毒不斷的發(fā)生變異，尤其是已有的研究發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)的高致病性人禽流感病毒具有高度變異的特點(diǎn)，需要及時(shí)更換疫苗株來(lái)確保有效疫苗的制備。 RG技術(shù)的興起，開(kāi)辟了高致病性人禽流感疫苗快速制備新紀(jì)元。 通過(guò)RG技術(shù)快速制備適合中國(guó)使用的高致病性人禽流感疫苗株，建立高效拯救流感病毒的技術(shù)平臺(tái)和全面系統(tǒng)的評(píng)價(jià)體系，從而鑒定合格的疫苗株和血清標(biāo)準(zhǔn)品送WHO確認(rèn)，為高致病性人禽流感疫苗的制備奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為應(yīng)對(duì)流感大流行做好技術(shù)儲(chǔ)備。

　　3.前景展望

　　反向遺傳操作技術(shù)發(fā)展至今天，載體的選擇已經(jīng)不是什么困難的事情了，關(guān)鍵還在于構(gòu)建的策略和思路。 隨著基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)微生物基因組序列進(jìn)行分析，在不需要培養(yǎng)病原體的情況下，從大量的抗原中篩選出研制疫苗的侯選抗原。相對(duì)于傳統(tǒng)疫苗學(xué)，它減少了鑒定疫苗抗原所需的時(shí)間和花費(fèi)，并能提供新的解決方案，對(duì)研究新型疫苗也有重要的參考價(jià)值［9］。 在拯救技術(shù)的日益發(fā)展成熟的基礎(chǔ)下，反向遺傳系統(tǒng)在RNA 病毒功能基因組的研究上也將擔(dān)當(dāng)無(wú)可替代的作用。 如流感M2蛋白胞漿尾被刪去5個(gè)或10個(gè)氨基酸殘基后，就會(huì)失去拯救流感病毒的能力；敲除NS2的病毒樣顆粒能用作疫苗的載體去表達(dá)外源蛋白，可以將其開(kāi)發(fā)為一種復(fù)制子載體，以轉(zhuǎn)移外源基因等，都需要通過(guò)構(gòu)造突變或缺失這些序列的人工病毒來(lái)闡明其具體功能。 應(yīng)用RNA 病毒反向遺傳系統(tǒng)重現(xiàn)病毒的生活周期和感染模式，對(duì)闡明病毒的起源、致病機(jī)制和免疫交叉保護(hù)提供一種切實(shí)可行的方法。 將來(lái)可結(jié)合感染性克隆對(duì)病毒起源和致病性進(jìn)行調(diào)查，開(kāi)展病毒拯救的機(jī)制研究。 直到現(xiàn)在，RNA 病毒的感染性克隆是如何模擬野生病毒感染的具體機(jī)理還沒(méi)有被系統(tǒng)闡明。 另外，盡管多種疫苗已經(jīng)開(kāi)發(fā)出來(lái)且實(shí)驗(yàn)室證明其有效的保護(hù)作用，但禽流感的發(fā)生卻沒(méi)有被消除，這就需要從病毒反向遺傳系統(tǒng)延伸到模式生物基因組背景下的“病毒宿主反向遺傳系統(tǒng)”，從而揭示禽流感跨宿主的改變機(jī)制是什么，也為預(yù)測(cè)人類(lèi)可能流感大流行的病毒株提供依據(jù)。 當(dāng)然也要正確看待病毒拯救技術(shù)的利弊，注意生物安全性，防止可能發(fā)生的病毒的流散和傳播。

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