【摘要】目的： 探討重組人骨形成蛋白2成熟肽（rhBMP2m）對γ射線輻射造血損傷小鼠的影響。 方法： 15只小鼠隨機分成3組：照射組、BMP治療組和對照組，每組5只。 照射組和BMP治療組均以60Coγ射線7.5 Gy照射200 s，對照組不接受照射。 照射后，照射組和對照組每日腹腔注射生理鹽水1 mL，BMP治療組注射等量0.5 g/L rhBMP2m生理鹽水稀釋液，各6 d. 照射后1， 3， 5， 7， 9， 11 d以尾靜脈采血觀察3組小鼠外周血白細(xì)胞、紅細(xì)胞及血小板變化；照射后11 d觀察照射組、BMP治療組小鼠脾結(jié)節(jié)形成數(shù)變化。 結(jié)果： 3組間小鼠的外周血白細(xì)胞、血小板數(shù)目隨時間的變化差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P<0.01），而外周血紅細(xì)胞數(shù)目隨時間的變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。 與對照組相比，照射組外周血白細(xì)胞［如（0.32±0.11）×109 vs （4.05±1.18）×109， 7 d］、紅細(xì)胞［如（6.73±1.68）×1012 vs （9.09±1.92）×1012， 7 d］、血小板計數(shù)［如（26.60±7.47）×109 vs （814.20±187.01）×109， 7 d］顯著下降 （P<0.01）；與照射組相比，BMP治療組外周血白細(xì)胞［如（1.61±0.31）×109 vs （0.32±0.11）×109， 7 d］、血小板計數(shù)［如（142.60±35.71）×1012 vs （26.60±7.47）×1012， 7 d］顯著增高 （P<0.01），外周血紅細(xì)胞數(shù)目雖然增高［如（7.38±2.22）×1012 vs （6.73±1.68）×1012， 7 d］，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；BMP治療組小鼠脾結(jié)節(jié)形成數(shù)顯著多于照射組（P<0.01）。 結(jié)論： BMP可提高γ射線放射損傷小鼠各系的造血細(xì)胞數(shù)目及脾結(jié)節(jié)形成數(shù)，具有促進造血功能恢復(fù)的作用。

　　【關(guān)鍵詞】  人重組骨形成蛋白2 放射損傷 造血功能 脾結(jié)節(jié)

　　0引言

　　骨形成蛋白（bone morphogenetic protein， BMP）屬于轉(zhuǎn)化生長因子β（TGFβ）超家族。 研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠皮下植入重組人骨形成蛋白2成熟肽（rhBMP2m），可引起間質(zhì)細(xì)胞聚集、軟骨形成，隨之出現(xiàn)骨替代、骨髓形成及骨塑性［1］。 在大量不同的實驗研究中，rhBMP2m 表現(xiàn)出良好的誘骨活性，在臨床上對于治療骨缺損、骨折、牙本質(zhì)修復(fù)等方面有廣闊的應(yīng)用前景。 rhBMP2m可減輕γ射線輻射所致的急性造血損傷，治療組小鼠的與造血相關(guān)指標(biāo)較照射對照組和對照組有顯著性增加（P<0.01），提示rhBMP2m可促進骨髓基質(zhì)細(xì)胞的分化、造血干細(xì)胞的形成及骨髓中造血干細(xì)胞的增殖，從而改善造血微環(huán)境，使輻射損傷后造血功能恢復(fù)［2-3］。 本研究旨在探討rhBMP2m對γ射線輻射造血損傷小鼠的治療作用。

　　1.材料和方法

　　1.1材料二級Balb/c小鼠15只，雄性，體質(zhì)量19～21 g，10周齡（第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供）；rhBMP2m（第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部教學(xué)實驗中心提供）使用前溶于生理鹽水，稀釋濃度為0.5 g/L，60Coγ射線源（第四軍醫(yī)大學(xué)輻照中心）。

　　1.2方法

　　1.2.1小鼠急性放射損傷模型的建立15只小鼠隨機分成3組：對照組、照射組和BMP治療組，每組5只。 照射組和BMP治療組均以60Coγ射線7.5 Gy（劑量率221.09 cGy/min）全身照射200 s，對照組不接受照射。

　　1.2.2治療照射后，照射組和對照組每日腹腔注射生理鹽水1 mL，BMP治療組注射等量0.5 g/L rhBMP2m生理鹽水稀釋液，各6 d.

　　1.2.3造血指標(biāo)觀察照射后1， 3， 5， 7， 9， 11 d以尾靜脈采血，觀察3組小鼠外周血白細(xì)胞、紅細(xì)胞及血小板變化；照射后11 d頸椎脫臼法處死小鼠，取照射組和BMP治療組小鼠脾臟，加入Bouin氏液固定24 h，觀察標(biāo)本脾結(jié)節(jié)的情況并計數(shù)。

　　統(tǒng)計學(xué)處理：  數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，所用統(tǒng)計學(xué)方法為重復(fù)測量設(shè)計資料的方差分析。

　　2.結(jié)果

　　2.1rhBMP2m對放射損傷小鼠外周血白細(xì)胞的影響3組間外周血白細(xì)胞數(shù)目隨時間的變化差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P<0.01）。 與對照組相比，照射組外周血白細(xì)胞數(shù)目顯著減少（P<0.01），并于第7日降至最低點，第9日開始回升；與照射組相比，BMP治療組外周血白細(xì)胞數(shù)目顯著增高（P<0.01，表1）。  表1rhBMP2m對放射損傷小鼠外周血數(shù)目的影響

　　2.2rhBMP2m對放射損傷小鼠外周血紅細(xì)胞的影響3組間外周血紅細(xì)胞數(shù)目隨時間的變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。 與對照組相比，照射組外周血紅細(xì)胞數(shù)目顯著減少（P<0.01）；與照射組相比，BMP治療組外周血紅細(xì)胞數(shù)目雖然增高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05， 表1）。

　　2.3rhBMP2m對放射損傷小鼠血小板的影響3組間外周血血小板數(shù)目隨時間的變化差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P<0.01）。 與對照組相比，照射組外周血血小板數(shù)目顯著減少（P<0.01）；與照射組相比，BMP治療組外周血血小板數(shù)目顯著增高（P<0.01，表1）。

　　2.4小鼠脾結(jié)節(jié)數(shù)BMP治療組小鼠脾結(jié)節(jié)數(shù)（32.80±8.81）， 顯著多于照射組小鼠脾結(jié)節(jié)數(shù)（6.00±8.81，P<0.01，圖1）。 對照組小鼠因沒有受到輻射損傷，所以沒有脾結(jié)節(jié)。

　　3.討論

　　BMP可誘導(dǎo)胚胎腹側(cè)中胚層的發(fā)生，形成含有血細(xì)胞的"間質(zhì)球". BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是決定胚胎細(xì)胞向造血細(xì)胞分化的關(guān)鍵，經(jīng)過剔除編碼BMP的基因而使BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙的小鼠將出現(xiàn)胚胎腹側(cè)中胚層發(fā)生障礙以及造血功能障礙［4-5］。 把BMP植入成年機體的肌肉或皮下，在誘導(dǎo)骨的同時還誘導(dǎo)骨髓的形成。 在軟骨形成后，血管侵入軟骨，小淋巴樣細(xì)胞聚集，圍繞血管出現(xiàn)大量造血干細(xì)胞，這些干細(xì)胞增殖、分化就形成造血性骨髓，這與胚胎發(fā)生時骨髓形成的過程相仿。

　　人骨形成蛋白2（human bone marrow morphogenetic protein2，hBMP2）的cDNA全長1188 bp，編碼396個氨基酸，定位于20號染色體p21區(qū)域［6］。 其被翻譯成前體蛋白后，切去氨基端的信號肽、前肽，兩個hBMP2單體再經(jīng)二聚化后分泌到細(xì)胞外。 hBMP2成熟肽含有114個氨基酸，其中包括7個在TGFβ家族中位置高度保守的半胱氨酸，6個半胱氨酸以3對鏈內(nèi)二硫鍵形成一個半胱氨酸結(jié)［7］；成熟肽N端第1～17肽存在一個肝素結(jié)合位點［8］；前肽、成熟肽、同時包括BMP家族其它成員均含有一共同的蛋白酶酶切位點RXXR［9］。 以上結(jié)構(gòu)可能和其所具有的誘骨活性，與胚胎發(fā)生、分化，神經(jīng)系統(tǒng)及造血系統(tǒng)分化、發(fā)育的誘導(dǎo)作用有密切關(guān)系。 利用基因工程技術(shù)，獲得重組人骨形成蛋白2 （rhBMP2）。

　　機體受到輻射時產(chǎn)生大量的自由基，引起生物大分子的損傷、DNA鏈斷裂、染色體畸變，引起突變、誘發(fā)腫瘤、造成早衰和壽命縮短等現(xiàn)象；同時，造血組織對輻射敏感，機體受照后造血組織變化的嚴(yán)重程度和照射劑量關(guān)系密切。 電離輻射不僅可以引起骨髓血竇的損傷，也能抑制和破壞造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells， HSC）［10］。 HSC是產(chǎn)生各系血細(xì)胞的最原始細(xì)胞，是維持機體正常造血、保證損傷后重建造血的關(guān)鍵細(xì)胞。 骨髓基質(zhì)細(xì)胞（bone marrow stromal cells， BMSC）又被稱為間質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells， MSC），它具有多向分化的潛能，同時能分泌多種造血生長因子和多種細(xì)胞黏附分子，對維持造血也有很重要的作用。 BMSC和細(xì)胞外基質(zhì)在體內(nèi)共同構(gòu)成造血微環(huán)境支持并參與調(diào)節(jié)HSC及其子代細(xì)胞的靜止、自我更新，干細(xì)胞的定位、增生、成熟，以及過成熟細(xì)胞的凋亡［11］。 免疫功能與造血功能密切相關(guān)，輻射能對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生持久的影響。 受照后，機體巨噬細(xì)胞、CD3+/CD8+T細(xì)胞和自然殺傷NK細(xì)胞顯著下降，且與照射劑量呈正相關(guān)，直接導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)功能的低下和紊亂，而引起感染造成機體死亡［12］。 而接受大劑量放療后的腫瘤患者和急性放射病患者的骨髓造血抑制，引起嚴(yán)重感染等并發(fā)癥是病人死亡的主要原因。

　　對人體多種造血細(xì)胞的檢測結(jié)果表明，這些細(xì)胞在正常狀態(tài)下分泌hBMP2，在正常造血組織中也可檢測到hBMP2［13］，同時正常骨髓造血干細(xì)胞表面表達BMPII型受體。 將BMP2植入成年動物的肌肉或皮下，在植入局部誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞形成骨、軟骨細(xì)胞和誘生新的造血灶。［醫(yī)學(xué)教育 網(wǎng) 搜集整理］

　　本實驗中，三組間小鼠的外周血白細(xì)胞、血小板數(shù)目隨時間變化的差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P<0.01），而外周血紅細(xì)胞數(shù)目隨時間的變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。 與對照組相比，照射組外周血白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板計數(shù)顯著下降（P<0.01），表明輻射對小鼠造血功能有損傷作用，其中粒細(xì)胞和血小板減少程度尤其明顯，提示小鼠受到輻射后出現(xiàn)造血干細(xì)胞急劇減少；與照射組相比，BMP治療組的外周血白細(xì)胞計數(shù)和血小板計數(shù)均顯著增高 （P<0.01），外周血紅細(xì)胞數(shù)目雖然增高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），可能與實驗動物數(shù)量偏少有關(guān)。 脾結(jié)節(jié)測定法是檢測小鼠造血干細(xì)胞在脾臟定居和形成集落能力的方法。 照射后，照射組小鼠脾臟有少量脾結(jié)節(jié)形成，提示機體可能仍有少量造血干細(xì)胞存活；同時BMP治療組小鼠脾臟有大量脾結(jié)節(jié)形成，其數(shù)目與照射組比較有非常顯著的差異（P<0.01），且BMP治療組小鼠脾結(jié)節(jié)的形態(tài)和大小存在差異，推測可能是由于不同系造血祖細(xì)胞定居于脾臟而形成的結(jié)果。 實驗結(jié)果說明BMP2對輻射所致造血損傷的修復(fù)或?qū)υ煅拇龠M作用是對全血細(xì)胞性的作用。 無論是輻射或是化療藥物所引起的造血損傷都是一種對各系造血細(xì)胞全面的損傷。 我們先前的實驗曾經(jīng)證實BMP促進造血損傷的作用優(yōu)于GMCSF，其原因可能為GMCSF只是針對GM系列的細(xì)胞，而BMP則是對各系細(xì)胞均有促進修復(fù)、增殖的作用可能是因為BMP誘導(dǎo)造血因子釋放，或者其本身即為造血因子。 rhBMP2通過什么樣的途徑誘導(dǎo)促進了造血的修復(fù)？這有待于進一步的研究。

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