【摘要】目的：觀察大鼠重型顱腦創(chuàng)傷后COX2的表達及選擇性COX2抑制劑NS398對大鼠重型顱腦創(chuàng)傷后學習記憶功能的影響。 方法： 采用Marmarous方法建立大鼠重型閉合性顱腦創(chuàng)傷模型， 將成年Wistar大鼠360只隨機分為腦創(chuàng)傷組、NS398治療組、假手術組，每組又分為傷后1， 3， 6， 12， 24， 48， 72， 96， 168及336 h 10 個時相組，另取120只作為正常對照組。 NS398治療組經(jīng)致傷后， 給予腹腔注射NS398 40 mg/（kg.d）， 直至各時相點處死； 腦創(chuàng)傷組、假手術組及正常對照組在相同時間給予等量的生理鹽水腹腔注射。 各組均在相應的時間點處死取材應用Western Blot方法及免疫組化法檢測COX2蛋白變化。 再取24只大鼠隨機分為腦創(chuàng)傷組、NS398治療組、假手術組及正常對照組，進行水迷宮測試。 結(jié)果： NS398能夠使大鼠腦內(nèi)COX2蛋白表達高峰明顯下調(diào)，使水迷宮測試的潛伏期明顯縮短。 結(jié)論：提示COX2與腦創(chuàng)傷后引發(fā)的繼發(fā)性腦損傷密切相關， NS398能夠明顯改善大鼠重型顱腦創(chuàng)傷后學習記憶障礙。

　　【關鍵詞】顱腦損傷 環(huán)氧合酶2 抑制劑NS398 Morris水迷宮 大鼠

　　0.引言

　　顱腦損傷后的繼發(fā)性因素是造成腦損傷發(fā)生、發(fā)展的重要原因，其中炎癥是腦創(chuàng)傷病理生理過程中的一個重要組成環(huán)節(jié)。 環(huán)氧合酶2（COX2）是花生四烯酸代謝的限速酶，后者產(chǎn)生的前列腺素及血栓素是腦創(chuàng)傷后炎癥級聯(lián)反應的重要介質(zhì)。 本實驗我們應用Western Blot法，免疫組化法，觀察應用選擇性COX2抑制劑NS398后大鼠腦內(nèi)COX2蛋白表達變化及Morris水迷宮測試其對腦創(chuàng)傷后學習記憶的影響。

　　1.材料和方法

　　1.1材料實驗動物取480只健康成年雄性Wistar大鼠（河南醫(yī)科大學實驗動物中心提供。 動物合格證號為醫(yī)動字第410117號）， 體質(zhì)量300～350 g， 隨機分成腦創(chuàng)傷組， NS398治療組，假手術組及正常組，每組120只，分別用于Western Blot（60只）及免疫組化法（60只）。 每組又分為傷后1， 3， 6， 12， 24， 48， 72， 96， 168及336 h 10個時相組。 另取24 只大鼠隨機分為腦創(chuàng)傷組、NS398治療組、假手術組及正常對照組，每組6只，進行水迷宮測試。

　　1.2方法

　　1.2.1大鼠模型制備動物用100 mL/L水合氯醛（400 mg/kg）腹腔注射麻醉成功后，參考Marmarous方法［1］造成大鼠重型彌漫性顱腦創(chuàng)傷，致傷高度2 m，致傷物質(zhì)量450 g. 傷后給予動物人工輔助呼吸及傷口清創(chuàng)縫合。 假手術組僅給予麻醉及頭皮切開、縫合，但不致傷。 正常對照組不做任何處理。［醫(yī)學教育網(wǎng) 搜集整理］

　　1.2.2給藥NS398純標準品由美國Neuomarker公司提供， NS398治療組于傷后即刻給于（40 mg/ kg）腹腔內(nèi)注射一次，以后給藥1次/d， 直至各時相點處死，同時腦創(chuàng)傷組、假手術組及正常對照組給于等量的生理鹽水腹腔注射。

　　1.2.3免疫組化檢測于上述傷后各時相點，對動物用100 mL/L水合氯醛（400 mg/kg）腹腔注射麻醉成功后，開胸， 40 g/L多聚甲醛經(jīng)心灌流固定10 min后，取出腦組織，置于40 g/L多聚甲醛后固定12～24 h （4℃）。 取出固定液中腦組織標本，常規(guī)脫水、石蠟包埋。 冠狀面連續(xù)切片，厚度約4 μm，經(jīng)黏片劑處理過的載玻片撈片，置于60℃烤箱烘烤1 h后， 嚴格按試劑盒說明操作，一抗為兔抗鼠COX2 mAb（天津灝陽生物技術有限公司提供）。 每次實驗均設陰性對照，以PBS代替一抗。 胞質(zhì)有棕褐色顆粒者為COX2陽性細胞。

　　1.2.4Western Blot技術檢測蛋白質(zhì)的表達動物斷頭后1 min內(nèi)小心取出新鮮腦組織，經(jīng)不同處理后，置于4℃預冷細胞裂解液中， 低溫離心后，保留上清， 采用考馬斯亮藍（CBB）G250蛋白定量法［2］測定蛋白質(zhì)濃度。 等量蛋白質(zhì)在120 g/L聚丙烯酰胺凝膠中電泳后，轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至硝酸纖維素膜上， 用50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h， 用鼠mAb COX2抗體（1∶100）在10 g/L的脫脂奶粉中4℃過夜。 再加入封閉液稀釋的二抗（稀釋度1∶500）室溫1 h； DAB顯色： TBST漂洗液漂洗3次，每次20 min于脫色搖床上，加入雙蒸水10倍稀釋的DAB顯色約10 min，見有清晰條帶出現(xiàn)即用PBS終止顯色，掃描并以CMIAS真彩色醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)軟件進行定量分析。

　　1.2.5Morris水迷宮測試嚴格按照Smith等［3］的方法，取24只大鼠隨機分為腦創(chuàng)傷組、NS398治療組、假手術組及正常對照組，于傷后7， 8， 9， 10 d進行學習記憶功能測試。

　　統(tǒng)計學處理： 實驗數(shù)據(jù)用x±s表示，使用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSDt檢驗。 P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

　　2.結(jié)果

　　2.1免疫組化正常對照組及假手術組，大鼠海馬CA3區(qū)及皮層偶見COX2陽性細胞，胞質(zhì)著色淺淡，陽性細胞以神經(jīng)元為主。 傷后3 h海馬CA3區(qū)及皮層COX2蛋白表達呈增強趨勢；傷后24 h海馬CA3區(qū)COX2蛋白表達達峰值； 48 h表達略有下降，而皮層COX2蛋白于傷后48 h表達達峰值； 72 h表達開始下降，至14 d天海馬CA3區(qū)及皮層COX2蛋白表達仍高于正常值（表1，2， 圖1，2）， NS398治療組顯示自傷后6 h起海馬CA3區(qū)及皮層COX2蛋白同創(chuàng)傷組相應時相點免疫反應相比明顯減輕，且具有顯著性差異（P<0.05， 圖3，4）。表1各組COX2蛋白在海馬CA3區(qū)灰度值表達量表2各組COX2蛋白在皮層灰度值表達量。

　　2.2COX　2 Western Blot于Mr為70×103左右見COX2棕色條帶，結(jié)果用平均灰度值表示。 結(jié)果提示，傷后6 h即出現(xiàn)COX2蛋白表達增強； 創(chuàng)傷組各條帶密度值逐漸加深，至傷后48 h COX2表達達峰值， 與假手術組比較極有顯著性差異（P<0.01）； 隨圖1腦創(chuàng)傷后24 h海馬CA3區(qū)COX2的表達×200。

　　2.3Morris水迷宮測試創(chuàng)傷組傷后第9日（P<0.01）及第10日（P<0.01）搜索安全島潛伏期較正常組及假手術組明顯延長， NS398治療組較創(chuàng)傷組明顯縮短。

　　3.討論

　　研究表明COX2在炎癥反應中發(fā)揮重要作用，是炎癥反應介導的細胞毒性重要的決定因素之一［4］。探討COX2在腦創(chuàng)傷后引起細胞損傷的機制，不得不提到中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在的一種很重要的興奮性受體谷氨酸受體，COX2反應產(chǎn)物PGE2可增強表4各組Morris水迷宮測試搜索安全島潛伏期離子型谷氨酸受體N 甲基 D天冬氨酸介導的神經(jīng)毒性作用，引起腦損傷［5］。 另外，COX2是花生四烯酸代謝的必需酶，其代謝產(chǎn)物前列腺素和血栓素A2（TXA2）產(chǎn)生增加，其中TXA2是目前已知最強的一種血管收縮因子，并且TXA2和前列腺素具有趨化性，可導致血小板和中性粒細胞黏附于血管內(nèi)皮細胞，從而加重傷后腦缺血，引起血管通透性變化，神經(jīng)細胞水腫，加重神經(jīng)元損傷。 其次，COX2作為前列腺素合成酶，催化PGG2轉(zhuǎn)變?yōu)镻GH2時生成大量的氧自由基，眾所周知，超氧離子能直接參與腦組織的損傷，或與NO形成氧化能力更強的過氧亞硝基， 引起腦組織損傷和細胞凋亡。 這類氧化損傷在腦創(chuàng)傷后繼發(fā)炎癥反應引發(fā)的細胞毒性中起了重要作用。 并且，近年來研究表明，腦損傷后COX2與誘導型一氧化氮合酶（iNOS）在相同的時間點于相臨近的細胞內(nèi)表達，并且NO可增強COX2的催化活性，增強氧自由基和毒性PG的合成，而COX2的催化產(chǎn)物氧自由基又可促進NO毒性作用，兩者相互作用引起腦損傷［6］。 以上種種機制均可引發(fā)損傷原發(fā)部位周圍的神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)及功能破壞，導致繼發(fā)性神經(jīng)細胞死亡，神經(jīng)元丟失，從而影響學習記憶功能的恢復。 并且，在缺血性腦損傷實驗中已發(fā)現(xiàn)過度表達COX2的轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生明顯的興奮毒性［7］，而COX2基因敲除的小鼠腦缺血后的梗死體積顯著縮小。 本實驗應用Western Blot技術，免疫組化法觀察到大鼠腦創(chuàng)傷后腦中COX2蛋白表達增多，且有規(guī)律性表達，這和Cernak等［8］通過復制大鼠彌漫性腦損傷模型中COX2蛋白表達的規(guī)律研究大致基本相似。 并發(fā)現(xiàn)經(jīng)NS398治療后大鼠腦中COX2蛋白表達明顯減少，且能顯著改善腦創(chuàng)傷后大鼠學習記憶功能，是大鼠腦創(chuàng)傷后治療的有效藥物。 考慮NS398的保護作用可能主要與減少花生四烯酸環(huán)氧酶途徑代謝產(chǎn)物有關。 但NS398其他方面的機制， 如： 減少氧化損傷、 抑制促炎細胞因子的產(chǎn)生及細胞凋亡等，是否也參與了腦創(chuàng)傷后的保護作用將有待于進一步深入研究。

　　總之，COX2作為前列腺素合成的一個重要的限速酶，如此持續(xù)高水平表達可能是由于氧化損害造成神經(jīng)細胞的持續(xù)損傷，前列腺素受體的介導，或是這些因素的共同作用所導致的基因表達水平的改變，這可能是造成繼發(fā)性腦損傷，促進神經(jīng)病理的進展，加重行為改變的根本原因。 故進一步研究COX2對神經(jīng)細胞的確切作用機制以及COX2選擇性抑制劑保護機制，從而為臨床上治療創(chuàng)傷性腦損傷等神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供新的途徑。

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