【摘要】  探討急性膽管炎狀態(tài)下細(xì)胞免疫中樞胸腺的變化以及中藥錦紅片的干預(yù)作用。方法：雄性清潔級SD大鼠24只，隨機(jī)分為3組，每組8只。膽總管單純結(jié)扎組（簡稱單純結(jié)扎組）：結(jié)扎膽總管，但不注射細(xì)菌，手術(shù)后喂生理鹽水；模型組：建立大鼠急性膽管炎模型，造模手術(shù)后喂生理鹽水；錦紅片治療組：造模手術(shù)后喂錦紅片懸液。手術(shù)后5 d處死大鼠，胸腺取材，做胸腺電鏡和光鏡形態(tài)學(xué)觀察，并檢測胸腺質(zhì)量、胸腺指數(shù)、凋亡指數(shù)、胸腺Bcl-2基因編碼蛋白表達(dá)和胸腺Fas基因編碼蛋白的表達(dá)。結(jié)果：形態(tài)學(xué)上凋亡細(xì)胞出現(xiàn)頻率由高到低依次為模型組、錦紅片治療組和單純結(jié)扎組。模型組胸腺質(zhì)量和胸腺指數(shù)均降低，與錦紅片治療組和單純結(jié)扎組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。模型組胸腺凋亡指數(shù)明顯高于錦紅片治療組和單純結(jié)扎組。錦紅片治療組Bcl-2基因編碼蛋白表達(dá)高于模型組，F(xiàn)as基因編碼蛋白表達(dá)組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：急性膽管炎時大鼠胸腺質(zhì)量、胸腺指數(shù)降低，胸腺凋亡指數(shù)升高，非生理性凋亡增加。清熱通下中藥錦紅片有一定的抑制這種非生理性凋亡的作用，這種作用可能是通過上調(diào)凋亡抑制基因Bcl-2編碼蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

　　【關(guān)鍵詞】  胸腺；膽管炎；清熱；通下；錦紅片

　　胸腺是機(jī)體的細(xì)胞免疫中樞，未成熟的T淋巴細(xì)胞通過在胸腺內(nèi)的分化、發(fā)育，成熟后釋放入血，以維持外周T淋巴細(xì)胞池的衡定［1］。凋亡是胸腺細(xì)胞維持外周T淋巴細(xì)胞質(zhì)和量的主要方式，其過程受到嚴(yán)格調(diào)控［2］。以往鮮有急性膽管炎與胸腺細(xì)胞凋亡方面的報道，而我們在過去的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，治療急性膽道感染方面療效顯著的清熱通下中藥錦紅片對膽管炎動物外周免疫反應(yīng)有調(diào)控作用［3～5］。為了解中藥錦紅片在治療急性膽管炎中對細(xì)胞免疫中樞胸腺的影響，我們進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)研究。

　　1 材料與方法

　　1.1 實(shí)驗(yàn)材料 清潔級SD大鼠，雄性，10周齡，體質(zhì)量160～180 g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。LIBROR AEL-160電子天平，日本島津公司產(chǎn)品；AHBT-5B顯微鏡，Olympus公司產(chǎn)品；TEM-1200透射電鏡，日本日立公司產(chǎn)品；石臘切片機(jī)，日本Aiwa公司產(chǎn)品；缺口末端標(biāo)記法（Tdt-mediated fluorescein-dUTP nick end labeling， TUNEL）試劑盒，Boehringer Mannheim公司產(chǎn)品；Bcl-2單克隆抗體（兔抗鼠IgG）和Fas單克隆抗體（兔抗鼠IgG），Gene公司產(chǎn)品；免疫組化試劑盒，福州邁新生物技術(shù)公司產(chǎn)品；蛋白酶K、DNA酶和二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine， DAB），Sigma公司產(chǎn)品。

　　1.2 實(shí)驗(yàn)方法 動物領(lǐng)來后放入實(shí)驗(yàn)場所3 d以適應(yīng)環(huán)境，造模前禁食8 h，禁水4 h.參照龔建平等［6］的造模方法，將實(shí)驗(yàn)大鼠膽總管結(jié)扎，同時向膽總管內(nèi)注入致病性大腸桿菌，建立大鼠急性膽道感染模型。

　　1.3 實(shí)驗(yàn)分組 24只SD大鼠隨機(jī)分為3組，每組8只。膽總管單純結(jié)扎組（簡稱單純結(jié)扎組）：結(jié)扎膽總管，但不注射細(xì)菌，手術(shù)后喂以生理鹽水。模型組：造模手術(shù)后喂以生理鹽水。錦紅片治療組：造模手術(shù)后喂錦紅片懸液，由上海中藥制藥一廠提供錦紅片干粉，以蒸餾水配成含干粉110 mg/ml的懸混液，按10 ml/kg體質(zhì)量灌胃，2次/d.于手術(shù)后第 5天 處死大鼠，胸腺取材。

　　1.4 檢測指標(biāo)

　　1.4.1 胸腺質(zhì)量和胸腺指數(shù) 完整取出胸腺后，電子天平稱取胸腺質(zhì)量，計算胸腺指數(shù)。胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）

　　1.4.2 光鏡觀察 胸腺組織以中性福爾馬林固定， 常規(guī)脫水，包埋，切片，脫臘至水，HE染色。

　　1.4.3 電鏡觀察 取約1 mm×2 mm的胸腺組織，用2.5%戊二醛固定，梯度脫水，包埋，超薄切片，醋酸鉛染色，透射電鏡下觀察。

　　1.4.4 Bcl-2基因編碼蛋白免疫組化 2 μm石臘切片，脫臘至水，3% H2O2室溫孵育5～10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，蒸餾水沖洗，用微波熱修復(fù)抗原，PBS浸泡5 min，5%～10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10 min；傾去血清，滴加1∶200 Bcl-2單抗100 μl，37 ℃孵育60 min或4 ℃過夜；PBS沖洗3次，5 min/次；滴加適當(dāng)比例的生物素標(biāo)記二抗100 μl，37 ℃孵育10～30 min；PBS沖洗 3次， 5 min/次；滴加適當(dāng)比例稀釋的抗生物素辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素，37 ℃孵育10～ 30 min； PBS沖洗3次，5 min/次，加DAB顯色；自來水充分沖洗，復(fù)染，封片。同時設(shè)立陰性對照，以正常兔血清代替一抗。

　　1.4.5 Fas基因編碼蛋白免疫組化 步驟基本同上，F(xiàn)as單抗工作濃度為1∶150.

　　1.4.6 TUNEL檢測 按原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明操作，即以生物素化脫氧三磷酸尿苷（deoxy-uridine triphosphate， dUTP）標(biāo)記DNA片段鈍端，再用免疫組化法放大標(biāo)記信號，用DAB顯色，蘇木素襯染。

　　1.4.7 切片分析 對TUNEL檢測、Bcl-2及Fas表達(dá)分析，在不告知動物分組信息的前提下，分別送復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院作閱讀分析并出具報告。

　　1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 胸腺質(zhì)量、胸腺指數(shù)、凋亡指數(shù)等用 x ±s表示，數(shù)據(jù)用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析。免疫組化數(shù)據(jù)用χ2檢驗(yàn)。

　　2 結(jié)果

　　2.1各組胸腺質(zhì)量和胸腺指數(shù) 模型組胸腺質(zhì)量和胸腺指數(shù)均降低，而錦紅片治療組均升高。見表1.

　　2.2 TUNEL檢測 高倍鏡下隨機(jī)計算各組每份標(biāo)本上、下、左、中、右5個視野的凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)（%）=（陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100.經(jīng)TUNEL標(biāo)記后，光鏡下凋亡細(xì)胞的核呈深棕色，標(biāo)記陽性細(xì)胞著色多位于細(xì)胞核周邊，核中央反應(yīng)不明顯，細(xì)胞結(jié)構(gòu)仍較完好。見表2、圖1.

　　表1 各組胸腺質(zhì)量和胸腺指數(shù)（略）

　　Table 1 The weight and index of thymus in three groups

　　*P <0.05，**P <0.01， vs untreated group.

　　表2 各組胸腺凋亡指數(shù)（略）

　　Table 2 The index of apoptosis of thymus in three groups

　　*P <0.05，**P <0.01， vs untreated group.

　　2.3 Bcl-2和Fas表達(dá)分析 Bcl-2陽性細(xì)胞著色多位于胞漿及胞膜。錦紅片治療組胸腺Bcl-2基因編碼蛋白表達(dá)與模型組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.01 ）。Fas陽性細(xì)胞著色多位于胞漿、胞膜，部分位于胞膜外。根據(jù)細(xì)胞有無著色、著色深淺及 著色細(xì)胞的比例擬定半定量評分。A項(xiàng)按顯色有無及顯色深淺計分：0分為不著色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；B項(xiàng)按顯色細(xì)胞的比例評分：1分為1%～10%，2分為11%～30%，3分為31%～50%，4分為51%以上。每例總積分=A×B，總積分0分為（ ），1～3分為（+），3～6分為（++），6分以上為（+++）。各組Bcl-2和Fas表達(dá)均檢測8份標(biāo)本，每張切片高倍鏡下隨機(jī)取上、下、左、中、右5個視野計數(shù)。結(jié)果見表3.

　　2.4 光鏡觀察 模型組胸腺皮質(zhì)變薄，有少量炎性細(xì)胞浸潤，胸腺細(xì)胞密度降低，有少量點(diǎn)狀壞死灶；錦紅片治療組胸腺皮質(zhì)較模型組厚，同單純結(jié)扎組基本相同，有少量炎性細(xì)胞浸潤，胸腺細(xì)胞數(shù)較模型組多，未見明顯壞死灶。

　　2.5 電鏡觀察 各組胸腺細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本相同，模型組胸腺中有較多巨噬細(xì)胞，可見大量典型的凋亡細(xì)胞，特征為染色質(zhì)濃縮、邊聚、核膜皺縮，微絨毛消失，凋亡小體形成，部分呈新月形，細(xì)胞膜完整，細(xì)胞器存在，可見凋亡小體被鄰近細(xì)胞及巨噬細(xì)胞吞噬現(xiàn)象。與TUNEL檢測到的胸腺凋亡指數(shù)結(jié)果相似，電鏡觀察到胸腺中的凋亡細(xì)胞比例以模型組最高，錦紅片治療組次之，單純結(jié)扎組最低。見圖2.

　　圖1 各組胸腺組織TUNEL陽性（×400）（略）

　　Figure 1 TUNEL positive thymus in three groups （×400）

　　A： Ligation group； B： Untreated group； C： Jinhong Tablet-treated group.

　　圖2 各組透射電鏡下胸腺細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)（×5 000）（略）

　　Figure 2 The structure of thymocyte in three groups under electron transmission microscopy （×5 000）

　　A： Ligation group； B： Untreated group； C： Jinhong Tablet-treated group

　　表3 胸腺Bcl-2和Fas基因編碼蛋白表達(dá)（略）

　　Table 3 Expressions of Bcl-2 and Fas gene coding proteins

　　3 討論

　　胸腺是T淋巴細(xì)胞成熟的場所，胸腺細(xì)胞成熟過程中，某些細(xì)胞克隆的清除、選擇，都涉及到凋亡機(jī)制，識別自身抗原的自身反應(yīng)T淋巴細(xì)胞在胸腺發(fā)育成熟后，甚至在發(fā)育過程中就經(jīng)凋亡途徑被清除。細(xì)胞數(shù)目的動態(tài)觀察表明，胸腺是一個大量產(chǎn)生短命細(xì)胞的場所，大多數(shù)胸腺淋巴細(xì)胞未發(fā)育成熟即已凋亡［7，8］。脂多糖靜脈注射能引起胸腺細(xì)胞凋亡，并且伴有血漿腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）含量升高，而抗TNF-α抗體可抑制引起的胸腺細(xì)胞DNA的片段化；IL-1、IL-2可分別抑制T細(xì)胞受體介導(dǎo)的未成熟胸腺細(xì)胞的凋亡和糖皮質(zhì)激素介導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞的凋亡［9～11］。細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控機(jī)制是近年研究的熱點(diǎn)，根據(jù)作用的不同，可將與細(xì)胞凋亡有關(guān)的基因分為凋亡促進(jìn)基因（稱自殺基因）和凋亡抑制基因（或稱生存基因）。Bcl-2是公認(rèn)的生存基因，F(xiàn)as則屬于自殺基因。凋亡活動是若干相關(guān)基因共同作用完成的，不可能是單一基因表達(dá)的結(jié)果［12，13］。通過凋亡過程死亡的胸腺皮質(zhì)細(xì)胞絕大多數(shù)不能表達(dá)Bcl-2，Bcl-2表達(dá)參與T細(xì)胞的保留；Fas與胸腺細(xì)胞的發(fā)育有關(guān)，F(xiàn)as系統(tǒng)與Bcl-2的相互作用決定了胸腺細(xì)胞的發(fā)育過程［14，15］。急性梗阻性膽管炎宿主胸腺細(xì)胞凋亡情況的變化鮮有報道。有資料顯示TNF-α、內(nèi)毒素體內(nèi)外均可誘導(dǎo)胸腺細(xì)胞凋亡［16，17］。本研究同期進(jìn)行的相關(guān)生化等實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組血漿內(nèi)毒素、TNF-α、IL-6、IL-8等增高，因此推測急性梗阻性膽管炎宿主胸腺細(xì)胞凋亡增多。本研究發(fā)現(xiàn)，與膽總管單純結(jié)扎組比較，模型組胸腺質(zhì)量明顯降低，胸腺指數(shù)降低（ P <0.01），胸腺皮質(zhì)變薄，胸腺細(xì)胞密度降低，凋亡指數(shù)增高（ P <0.05），并出現(xiàn)大量典型的凋亡小體，提示模型組胸腺細(xì)胞凋亡明顯增加，雖然鏡下觀察到模型組胸腺有少量點(diǎn)狀壞死灶，但這不應(yīng)成為胸腺質(zhì)量減輕的主要原因。結(jié)合同期其他的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測外周血中CD3、CD4淋巴細(xì)胞減少是細(xì)胞免疫中樞胸腺細(xì)胞凋亡增多，導(dǎo)致效應(yīng)細(xì)胞減少所致。 錦紅片治療組胸腺質(zhì)量及胸腺指數(shù)明顯高于模型組，表明中藥治療后胸腺受損程度明顯減輕，有保護(hù)胸腺的作用。并且錦紅片治療組胸腺凋亡指數(shù)明顯低于模型組，可以認(rèn)為，錦紅片能抑制胸腺細(xì)胞的過度凋亡，以此維持機(jī)體細(xì)胞免疫功能的相對穩(wěn)定。中藥抑制胸腺細(xì)胞的凋亡可能與其誘導(dǎo)內(nèi)毒素耐受有關(guān)。有報道稱反復(fù)多次注射小劑量內(nèi)毒素的動物其胸腺質(zhì)量、胸腺指數(shù)及胸腺活細(xì)胞數(shù)均明顯高于一次注射大劑量內(nèi)毒素，而梯狀DNA則減少，并且，隨注射內(nèi)毒素量的增加，對胸腺的保護(hù)作用越強(qiáng)［1］。同期的研究中錦紅片治療組血漿內(nèi)毒素明顯低于模型組，實(shí)際起到了誘導(dǎo)內(nèi)毒素耐受、保護(hù)胸腺的作用。本研究錦紅片治療組Bcl-2基因編碼蛋白表達(dá)多于模型組，而且細(xì)胞凋亡也較少，F(xiàn)as基因編碼蛋白表達(dá)組間無明顯差異，推測具有清熱通下作用的中藥錦紅片可能是通過促進(jìn)Bcl-2基因編碼蛋白的表達(dá)而在一定程度上抑制了細(xì)胞凋亡。

　　【參考文獻(xiàn)】

　　1Pi YQ， Wang DH， Deng GH， et al. Protection of thy-mocytes against apoptosis induced by lethal dose of lipopolysaccharide in endotoxin tolerant mice. Hunan Yi Ke Da Xue Xue Bao. 1996； 21（3）： 187-191. Chinese with abstract in English.皮業(yè)慶， 王殿華， 鄧恭華， 等。 內(nèi)毒素耐受性與胸腺細(xì)胞凋亡。 湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報。 1996； 21（3）： 187-191.

　　2 Yu ZD. Progress in molecular biological research on apoptosis of thymocytes. Guo Wai Yi Xue Lin Chang Sheng Wu Hua Xue Yu Jian Yan Xue Fen Ce. 1998； 19（2）： 89-91. Chinese.余振東。 胸腺細(xì)胞凋亡的分子生物學(xué)研究進(jìn)展。 國外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊。 1998； 19（2）： 89-91.

　　3 Zhu PT， Zhang JZ， Gao J， et al. Experimental study on “Jinhong Pill” in regulating cytokine and preventing in-testinal mucosal barrier of acute biliary tract infection in rats. Shanghai Zhong Yi Yao Za Zhi. 2001； 35（4）： 39-42. Chinese with abstract in English.朱培庭， 張靜 ， 高炬， 等。 錦紅片對急性膽道感染大鼠細(xì)胞因子調(diào)節(jié)和腸黏膜屏障保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究。 上海中醫(yī)藥雜志。 2001； 35（4）： 39-42.

　　4 Zhang JZ， Zhu PT， Gao J， et al. The protective impact of tablet Jinhong on enteral mucosal barrier in the treat-ment of acute biliary tract infections， an experimental study. J Gastrointest Surg. 2004； 8（7s）： 442A.

　　5 Zhang JZ， Zhang XL， Gao J， et al. Impact of antipyret-ic and purgative herbs on intestinal mucosal barrier and inflammatory response in treatment of acute cholangitis in rats. Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao. 2005； 3（3）： 211-215. Chinese with abstract in English.張靜 ， 章學(xué)林， 高炬， 等。 清熱通下中藥對膽管炎大鼠腸屏障保護(hù)和炎癥反應(yīng)調(diào)控的研究。 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報。 2005； 3（3）： 211-215.

　　6 Gong JP， Han BL， Luo D， et al. Research on intestinal mucosal barrier damage of acute infection of biliary tract. Zhonghua Shi Yan Wai Ke Za Shi. 1991； 8（3）： 115-116. Chinese.龔建平， 韓本立， 羅丁， 等。 急性膽道感染時腸粘膜屏障損傷的研究。 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志。 1991； 8（3）： 115-116.

　　7 Surh CD， Sprent J. T-cell apoptosis detected in situ during positive and negative selection in the thymus. Nature. 1994； 372（6501）： 100-103.

　　8 Berke G. The CTL‘s kiss of death. Cell. 1995； 81（1）： 9-12.

　　9 Zhang YH， Takahashi K， Jiang GZ， et al. In vivo in-duction of apoptosis （programmed cell death） in mouse thymus by administration of lipopolysaccharide. Infect Immune. 1993； 61（12）： 5044-5048.

　　10 Ayala A， Herdon CD， Lehman DL， et al. The induc-tion of accelerated thymic programmed cell death during polymicrobial sepsis： control by corticosteroids but not tumor necrosis factor. Shock. 1995； 3（4）： 259-267.

　　11 Norimatsu M， Ono T， Aoki A， et al. In-vivo induction of apoptosis in murine lymphocytes by bacterial lipopo-lysaccharides. J Med Microbiol. 1995； 43（4）： 251- 257.

　　12 Chen LJ， Song XH， Li B， et al. Effects of anti- endotoxin monoclonal antibody on thymocytes apoptosis and expression of interleukin 1β-conventing enzyme in septic mice. Zhonghua Shi Yan Wai Ke Za Zhi. 1998； 15（3）： 269-270. Chinese with abstract in English.陳立軍， 宋旭華， 李濱， 等。 抗內(nèi)毒素單抗對膿毒癥小鼠胸腺細(xì)胞凋亡及白介素1β-轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)的影響。 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志。 1998； 15（3）： 269-270.

　　13 Ming XZ. Progress in control of apoptosis. Guo Wai Yi Xue Zhong Liu Xue Fen Ce. 1998； 25（6）： 321-323. Chinese.明學(xué)志。 細(xì)胞凋亡調(diào)控及其進(jìn)展。 國外醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)分冊。 1998； 25（6）： 321-323.

　　14 Migliorati G， Nicoletti I， Pagliacci MC， et al. Interleu-kin-4 protects double-negative and CD4 single-positive thymocytes from dexamethasone-induced apoptosis. Blood. 1993； 81（5）： 1352-1358.

　　15 Tanaka M， Suda T， Yatomi T， et al. Lethal effect of recombinant human Fas ligand in mice pretreated with Propionibacterium acnes. J Immunol. 1997； 158（5）： 2303-2309.

　　16 Hernandez-Caselles T， Stutman O. Immune functions of tumor necrosis factor. I. Tumor necrosis factor induces apoptosis of mouse thymocytes and can also stimulate or inhibit IL-6-induced proliferation depending on the concentration of mitogenic costimulation. J Immunol. 1993； 151（8）： 3999-4012.

　　17 Fang BW， Wu XZ. Induction of apoptosis in infection state. Guo Wai Yi Xue Wai Ke Xue Fen Ce. 1999； 26（2）： 71-73. Chinese.方步武， 吳咸中。 感染相關(guān)狀態(tài)下凋亡的誘導(dǎo)。 國外醫(yī)學(xué)外科學(xué)分冊。 1999； 26（2）： 71-73.