【關(guān)鍵詞】  血管內(nèi)皮生長因子類；P33ING1；胃腫瘤；免疫組織化學(xué)

　　Relationship  of vascular endothelial growth factor and p33ING1 with biological behaviors of gastric carcinoma

　　LIANG QiLian， CHEN XiaoDong， WANG SanMing， LI JianWen， ZHENG ZhaoHui， HUANG Bing

　　Oncology Center， Affiliated Hospital，  Guangdong Medical College， Zhanjiang 524001， China

　　【Abstract】 AIM： To study the expressions of vascular endothelial growth factor（VEGF） and P33ING1  in  gastric carcinoma， and their relations to the clinicopathological features. METHODS： VEGF  protein and P33ING1 protein expressions in 102 cases of human gastric carcinoma tissues and normal tissues around the foci were examined by using immunohistochemistry. RESULTS： The expression of VEGF was high in carcinoma tissues while low in normal tissues（χ2=68.0， P<0.01）， as for P33ING1， the patter  was contrary（χ2=40.3， P<0.01）。 The expression of VEGF was related to serosa invasion， TNM stage， lymph node metastasis and 5year survival rate （P<0.05）。 There was a close relation between the expression of P33ING1 and tumor location， serosa invasion， TNM stage， lymph node metastasis and 5year survival rate （P<0.05）。 CONCLUSION：  VEGF and P33ING are positively correlated with biological behaviors of gastric carcinoma， suggesting that examination by using immunohistochemistry  for  VEGF and P33ING1 may be of value in making diagnosis， evaluating evolution of disease in patients with gastric carcinoma at the same time.

　　【Keywords】  vascular endothelial growth factors； p33ING1；  stomach neoplasm； immunohistochemistry

　　【摘要】 目的： 研究血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）和抑癌基因P33ING1蛋白表達(dá)與胃癌臨床特征之間的關(guān)系。 方法： 采用免疫組化法檢測102例胃癌患者手術(shù)切除的癌組織和癌周正常組織中VEGF 和P33ING1表達(dá)水平。  結(jié)果： VEGF在正常組織中呈高表達(dá)，在腫瘤組織中呈低表達(dá)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=68.0， P<0.01）；P33ING1在正常組織中呈高表達(dá)，在腫瘤組織中呈低表達(dá)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=40.3， P<0.01）。 VEGF蛋白表達(dá)水平與胃癌漿膜浸潤、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、5 a生存率有關(guān)（P<0.05），P33ING1蛋白表達(dá)水平與胃癌腫瘤部位、漿膜浸潤、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、5 a生存率有關(guān)（P<0.05）。 結(jié)論： VEGF與P33ING1的表達(dá)和胃癌生物學(xué)行為有關(guān)，同時(shí)進(jìn)行VEGF與P33ING1免疫組化法檢測對胃癌患者病情判斷和預(yù)后評價(jià)有一定的臨床意義。

　　【關(guān)鍵詞】 血管內(nèi)皮生長因子類；P33ING1；胃腫瘤；免疫組織化學(xué)

　　0引言

　　胃癌是我國人群中常見的消化道惡性腫瘤之一，其死亡率高居惡性腫瘤死亡率前幾位，然而有關(guān)胃癌發(fā)生發(fā)展確切的分子機(jī)制仍不十分清楚，其中血管生長因子及抑癌基因的影響倍受關(guān)注。 血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF ）是目前發(fā)現(xiàn)最重要的血管生長因子，它與腫瘤患者預(yù)后是近幾年的研究熱點(diǎn)，P33ING1是新近克隆出來的一種抑癌基因，在人類許多腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)存在P33ING1表達(dá)降低，并參與部分腫瘤的演進(jìn)過程。 我們采用免疫組化方法檢測VEGF和P33ING1蛋白在胃癌中的表達(dá)，探討兩者與胃癌生物學(xué)行為和預(yù)后的關(guān)系。

　　1材料和方法

　　1.1材料收集廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院199701/200212病理科歸檔的病歷資料完整的102例胃癌組織標(biāo)本，按全國胃癌協(xié)作組病理規(guī)范進(jìn)行病理診斷和分級，在研究中，將腫瘤細(xì)分成兩個(gè)組織學(xué)亞型：分化程度較好包括乳頭狀腺癌和管狀腺癌，分化程度較差包括低分化腺癌、粘液細(xì)胞癌和印戒細(xì)胞癌，所有患者術(shù)前均未行化療或放療。 同時(shí)另取癌旁非腫瘤的正常組織石蠟標(biāo)本為對照。 抗VEGF鼠源單克隆一抗購自福州邁新試劑公司；抗P33ING1鼠源單克隆一抗購自美國抗體診斷試劑公司，為雜交瘤培養(yǎng)上清，不稀釋；Envision免疫組織化學(xué)試劑盒購于丹麥Dako公司。

　　1.2方法

　　1.2.1常規(guī)病理學(xué)檢查所有標(biāo)本均經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為40 g/L甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色供病理觀察。 腫瘤組織學(xué)分級參照國際胃癌組織學(xué)分級標(biāo)準(zhǔn)。

　　1.2.2免疫組化檢測石蠟包埋組織以4 μm厚度連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟至水，切片浸于50mmol/L（PH80）乙二胺四乙酸溶液中，微波抗原修復(fù)10 min，冷卻至室溫，充分水洗，PBS浸洗，滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min；甩去多余液體，不洗，加入VEGF單抗或P33ING1單抗4℃過夜；PBS洗；滴加SP 9000通用型生物素標(biāo)記二抗，37℃，40  min；DAB顯色30 s，蘇木素復(fù)染，系列乙醇脫水、透明、中性樹膠封固。 DAB顯色液配制：取DAB 5 mg溶于100 mL 0.05 mol/L TrisHCL（pH 7.6）中，加入300 mL/L過氧化氫10 μL，攪拌混勻后過濾（用前新鮮配制）；對照設(shè)置：正常小鼠血清代替一抗作替代對照，PBS作空白對照。

　　1.2.3陽性結(jié)果的判定和圖像分析對于VEGF，在光鏡下有棕黃色顆粒反應(yīng)出現(xiàn)在細(xì)胞膜、細(xì)胞漿中均為陽性反應(yīng)細(xì)胞，高倍鏡下陽性細(xì)胞數(shù)占視野10%以下為陰性（-）；高倍鏡下陽性細(xì)胞數(shù)占視野10%以上為有意義，計(jì)為陽性。 10%～30%為（+），30%～50%為（），>50%為（），（+）～（）均表示為陽性（+）。 對于P33ING1，在光鏡下有棕黃色顆粒反應(yīng)出現(xiàn)在細(xì)胞漿中為陽性反應(yīng)細(xì)胞，高倍鏡下陽性細(xì)胞數(shù)占視野25%以下為陰性（-）；高倍鏡下陽性細(xì)胞數(shù)占視野25%以上為有意義，計(jì)有陽性。 25%～50%為（+），50%～75%為（），>75%為（），（+）～（）均表示為陽性（+）。

　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用簡明統(tǒng)計(jì)分析軟件。 各組間差異用χ2檢驗(yàn)，取α=0.05檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

　　2結(jié)果

　　2.1VEGF和P33ING1蛋白在胃癌組織與癌旁正常組織中的表達(dá)情況VEGF蛋白在胃癌組織中的陽性表達(dá)率為50.0%（51/102），在癌旁正常組織中的陽性表達(dá)率為0，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=68.0， P<0.01）；P33ING1蛋白在胃癌組織中的陽性表達(dá)率為53.9%（55/102），在癌旁正常組織中的陽性表達(dá)率為93.1%（95/102），兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=40.3， P<0.01）。

　　2.2VEGF蛋白在胃癌組織中的表達(dá)與臨床病理因素之間關(guān)系（表1）結(jié)果表明VEGF蛋白表達(dá)水平與胃癌漿膜浸潤、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05）。

　　表1VEGF蛋白表達(dá)水平與胃癌臨床病理因素的關(guān)系（略）

　　2.3P33ING1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)與臨床病理因素之間關(guān)系結(jié)果表明P33ING1蛋白表達(dá)水平與胃癌腫瘤部位、漿膜浸潤、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05，表2）。

　　2.4VEGF和P33ING1蛋白表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系102例胃癌患者中有隨訪資料的93例，5 a生存率：Ⅰ期為82.7%，Ⅱ期為51.8%，Ⅲ期為13.7%，Ⅳ期為1.3%. VEGF表達(dá)陰性的患者5 a生存率明顯高于VEGF表達(dá)陽性的患者，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=19.4， P<0.01），前者為63.4%，后者為31.2%. P33ING1表達(dá)陽性的患者5 a生存率明顯高于P33ING1表達(dá)陰性的患者，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=14.6， P<0.01），前者為65.6%，后者為37.6%.

　　表2P33ING1蛋白表達(dá)水平與胃癌臨床病理因素的關(guān)系（略）

　　3討論

　　實(shí)體瘤的生長離不開新生血管，腫瘤不僅通過新生血管獲取癌組織生長所必需的氧和營養(yǎng)物質(zhì)，并通過血管浸潤周圍臟器發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。 血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）是Ferrara等［1］從牛垂體濾泡細(xì)胞培養(yǎng)液中分離出的一種高度特異性促血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂的生長因子，是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)烈的血管通透性因子，比組胺作用強(qiáng)50000倍，是Mr（34～45）×103的高度糖基化堿性蛋白，由Mr（17～22）×103的同源雙聚體構(gòu)成；VEGF是一種高度特異的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂素，其主要生物學(xué)功能［2］： ① 刺激血管生成；② 促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增生和遷移；③ 增加血管尤其是微小血管的滲透性，使血漿大分子外滲沉積在血管外基質(zhì)中，為腫瘤細(xì)胞的生長和新生毛細(xì)血管網(wǎng)的建立提供營養(yǎng)；④ 促進(jìn)某些蛋白水解酶的作用使基質(zhì)降解。 以上作用均有助于腫瘤的血管形成、浸潤與轉(zhuǎn)移。 多數(shù)實(shí)體瘤均過度表達(dá)VEGF，在某些腫瘤中已將其作為一種新的腫瘤標(biāo)志物，與其他實(shí)體腫瘤一樣， 胃癌的發(fā)生、發(fā)展也與腫瘤血管生成有關(guān)。 Saito等［3］研究提示VEGF表達(dá)陽性的胃癌患者的5 a生存率為33.0%，而VEGF表達(dá)陰性的胃癌患者的5 a生存率為67.6%，且經(jīng)多因素分析提示VEGF為一獨(dú)立的預(yù)后因素。

　　本組通過Envision免疫組織化學(xué)法測定結(jié)果表明VEGF在胃癌的腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于正常組織，且在腫瘤組織中VEGF蛋白表達(dá)強(qiáng)度與漿膜浸潤、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、5 a生存率等呈相關(guān)性，提示VEGF可作為考量腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力、反映胃癌生物學(xué)行為的一個(gè)重要指標(biāo)。

　　Garkavtesev等［4］采用cDNA消減雜交法（subtractive hybridization）建立了1種從富含所需序列的cDNA文庫中構(gòu)建較簡便GSEs（genetic suppressor elements） 文庫的方法，并結(jié)合體內(nèi)選擇技術(shù)（in vivo selection assay），成功克隆出一個(gè)新基因。 用該基因cDNA片段反向插入表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染小鼠永生化乳腺上皮細(xì)胞后，接種于裸鼠皮下可以成瘤；體外軟瓊脂集落形成試驗(yàn)，集落數(shù)至少是對照組的50倍。 所有這些結(jié)果都提示，這個(gè)基因在正常情況下對細(xì)胞的生長具有抑制作用；用反義mRNA可以阻斷其作用，進(jìn)細(xì)胞的生長和惡性轉(zhuǎn)化，因而命名為inhibitor of growth（ING），并且由于這個(gè)基因可能是該家族的第一個(gè)成員，故而稱之為ING1.

　　ING1基因定位于13q3334，其編碼的蛋白質(zhì)分子量為33 ku，故命名為P33ING1，在人類各種正常組織細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)［5-7］。 P33ING1蛋白質(zhì)的高表達(dá)可抑制細(xì)胞生長增殖，使細(xì)胞停滯于G0/G1期，并有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用［8］。 而P33ING1蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)，則可促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。 Tokunaga等［9］分別從蛋白和mRNA轉(zhuǎn)錄水平檢測24例乳腺癌組織中的P33ING1 mRNA含量，相對于正常組織有17例表達(dá)下降（78.8%），原位雜交結(jié)果顯示，P33ING1 mRNA在進(jìn)展期乳腺癌比早期癌及癌旁組織少；祝峙等［10］用免疫組化法檢測57例肝癌及癌周邊正常肝組織中P33ING1蛋白，證實(shí)在肝癌組織中P33ING1白表達(dá)明顯低于正常肝組織；Oki等［11］研究發(fā)現(xiàn)12株胃癌細(xì)胞僅1例存在P33ING1突變，15/20的胃癌組織卻表現(xiàn)為P33ING1 mRNA顯著降低，結(jié)果說明P33ING1在胃腸道腫瘤形成中其抑癌基因的作用［6］。

　　我們結(jié)果表明，P33ING1在胃癌的腫瘤組織中的表達(dá)強(qiáng)度明顯減低，且在腫瘤組織中P33ING1蛋白表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤部位、漿膜浸潤、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、5 a生存率等呈相關(guān)性。 VEGF和P33ING1蛋白表達(dá)與胃癌的侵襲性生長特性有關(guān)。

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