【摘要】目的： 了解臨床分離的革蘭陰性桿菌中產(chǎn)ESBLs的流行特征及ESBLs基因型。

　　方法： 對(duì)我院臨床分離的革蘭陰性桿菌，采用改良三維試驗(yàn)檢測(cè)產(chǎn) ESBLs 菌株，用PCR對(duì) ESBLs 基因進(jìn)行分型。 結(jié)果： 175株革蘭陰性桿菌分離出49株產(chǎn)ESBLs 菌，陽性率28%，包括大腸埃希菌、克雷伯菌屬、陰溝腸桿菌、弗勞地枸椽酸桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌。 其中，第一位是陰溝腸桿菌（34.7%，17/49），其次是大腸埃希菌（30.6%，15/49）。 每種細(xì)菌產(chǎn)ESBLs率前三位是陰溝腸桿菌（56.6%，17/30），大腸埃希菌（37.5%，15/40），肺炎克雷伯菌（25.0%，6/24）。 各病區(qū)中神經(jīng)科產(chǎn)ESBLs菌分離率最高（32.7%）。 49株產(chǎn)ESBLs 菌攜帶TEM， SHV， CTXM分別為34，5，16株，有17株同時(shí)攜帶兩種β內(nèi)酰胺酶基因的菌株，占34.7%， 其中TEM+CTXM型13株，占基因雙陽性菌株的76.5%。

　　 結(jié)論：我院產(chǎn)ESBLs菌以陰溝腸桿菌、大腸埃希菌為主。 神經(jīng)科是主要產(chǎn)ESBLs菌的病區(qū)。 ESBLs基因以 TEM 型、CTXM 型為主，攜帶雙基因的菌株在我院有流行。

　　【關(guān)鍵詞】  革蘭陰性桿菌 β內(nèi)酰胺酶類 三維試驗(yàn) 基因型

　　0.引言

　　超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ Extendedspectrum betalactamases， ESBLs）是質(zhì)粒介導(dǎo)的由β內(nèi)酰胺酶（BLA）基因突變而形成的一類酶，是絲氨酸蛋白酶的衍生物。 它可水解頭孢噻肟（CTX），頭孢他啶（CAZ）等三代頭孢菌素和單環(huán)酰胺類抗生素，并可被β內(nèi)酰胺酶抑制劑（如克拉維酸）抑制［1］。 自1983年德國首次從臭鼻克雷伯桿菌中分離出SHV2基因型ESBL以來，其數(shù)量及種類已在世界各地迅速增長。 ESBLs基因型主要分為SHV，TEM，CTXM，OXA型和其他型，目前已發(fā)現(xiàn)200多種。 不同的國家、地區(qū)、醫(yī)院因其使用抗生素的種類和劑量不同，產(chǎn)ESBLs細(xì)菌的檢出率、耐藥性、基因型也有所差異。 為了解蘭州大學(xué)第二醫(yī)院革蘭陰性桿菌產(chǎn)ESBLs的流行狀況和基因分型，我們對(duì)49株革蘭陰性桿菌進(jìn)行了ESBLs的確認(rèn)及其基因型測(cè)定。

　　1.材料和方法

　　1.1材料頭孢噻肟（CTX，30 μg/片），頭孢硝噻吩紙片（Nitrocefin），MH瓊脂購自英國Oxiod公司；克拉維酸（山西威奇達(dá)藥業(yè)有限公司）， 氯唑西林（山西博康藥業(yè)有限公司 ）；TaKaRa質(zhì)粒DNA純化盒，TaKaRa PCR 擴(kuò)增盒， DNA Marker D3405A，引物購自寶生物（大連）有限公司。 PCR分析儀（美國PERKIN ELMER），凝膠成像儀（德國Herolab），ABI DNA 測(cè)序儀（美國PE），電泳儀（北京六一儀器廠）。 大腸埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌700603（衛(wèi)生部臨檢中心）。 200505～09我院臨床分離菌175株革蘭陰性桿菌。

　　1.2方法

　　1.2.1改良三維試驗(yàn)對(duì)待測(cè)菌株利用凍融法獲取粗酶提取液，濾菌器過濾后測(cè)定β內(nèi)酰胺酶呈陽性待用。 將CTX紙片貼于涂布了大腸埃希菌ATCC 25922的MH平板中央，具其5 mm處用刀片向外分別切四個(gè)裂隙，在各裂隙中分別加入待測(cè)粗酶液（30 μL），粗酶液（30 μL）+克拉維酸液（2 mmol/L  10 μL），粗酶液（30 μL）+氯唑西林液（2 mmol/L  10 μL），粗酶液（30 μL）+克拉維酸液（2 mmol/L  10 μL）+氯唑西林液（2 mmol/L  10 μL），35℃過夜培養(yǎng)。

　　1.2.2ESBLs基因型酶（TEM， SHV， CTXM1型）PCR擴(kuò)增 ① 引物設(shè)計(jì)： TEM型 T1（5′ATA AAA TTC TTG AAG ACG AAA3′），T2（5′GAC AGT TAC CAA TGC TTA ATC A3′）， 終產(chǎn)物1075 bp；SHV型S1（5′GGG TTA TTC TTA TTT GTC GC3′），S2（ 5′TTA GCG TTG CCA GTG CTC3′）， 終產(chǎn)物928 bp；CTXM1型C1（ 5′GGC CCA TGG TTA AAA AAT CAC TGC3′），C2（5′CCG TTT CCG CTA TTA CAA ACC GTC G3′） 終產(chǎn)物826 bp. ② 質(zhì)粒提取：挑選待測(cè)菌單個(gè)菌落接種至2.5  mL含有氨芐西林（50 mg/L）的LB培養(yǎng)基35℃過夜培養(yǎng)，經(jīng)23 000 g離心2 min，沉淀物采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA. ③ 反應(yīng)體系： 引物各0.25   μL， 10×PCR Buffer（+）（Mg2+PLus）5 μL，dNTP 4 μL，Taq酶0.25 μL，質(zhì)粒模板2 μL，加去離子水至50 μL. ④ 反應(yīng)參數(shù)：TEM型 變性94℃ 45 s，退火50℃ 45 s，延伸72℃ 1 min共30個(gè)循環(huán)；SHV型 變性94℃ 30 s，退火55℃ 30 s，延伸72℃ 1 min共30個(gè)循環(huán)；CTX–M型 變性94℃ 45 s，退火59℃ 45 s，延伸72℃ 1 min共30個(gè)循環(huán)。

　　1.2.3PCR產(chǎn)物測(cè)序PCR產(chǎn)物送寶生物（大連）有限公司，采用Sanger雙脫氧鏈終止法測(cè)序，結(jié)果直接在GenBank中進(jìn)行序列比對(duì)分析。

　　1.2.4PCR產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣于40 g/L聚丙烯酰胺凝膠，以8 V/cm的電壓下進(jìn)行電泳30 min后，經(jīng)0.5 mg/L溴化乙錠染色，凝膠置于凝膠成像儀攝像。

　　2.結(jié)果

　　2.1產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌的菌株分布175株臨床分離菌株檢出49株ESBLs表型陽性菌，陽性率28%. 產(chǎn)ESBLs菌株中，最常見的是陰溝腸桿菌，其次是大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌，最少見的是弗勞地枸櫞酸菌（表1）。 各類革蘭陰性桿菌產(chǎn)ESBLs率最高為陰溝腸桿菌，其次是大腸埃希菌、克雷伯菌屬，銅綠假單胞菌產(chǎn)ESBLs率最低。 表1革蘭陰性桿菌產(chǎn)ESBLs的分離率

　　2.2產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌的科室分布產(chǎn)ESBLs菌在醫(yī)院各科室廣泛存在，神經(jīng)科中比例最高，達(dá)32.7%（表2）。 表249株產(chǎn)ESBLs菌的病區(qū)分布

　　2.3產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌基因分型攜帶TEM型β內(nèi)酰胺酶基因的菌株為34株（69.3%），攜帶SHV型、CTXM型基因的菌株分別為5株（10.2%）、16株（34.7%），其他型別11株（22.4%）。 其中，有17株同時(shí)攜帶兩種β內(nèi)酰胺酶基因的菌株，占34.7%，TEM+CTXM型13株（26.5%），TEM+SHV型3株（10.2%），SHV型+CTXM1株（2.0%）。 各型PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳見圖1，菌株詳細(xì)ESBL基因分型。

　　3.討論

　　產(chǎn)ESBLs菌株主要引起醫(yī)院感染和流行。 從對(duì)本院的研究表明，我院產(chǎn)ESBLs菌分布范圍廣，分離率高。 其中所占比例最高的是陰溝腸桿菌（34.7%），其次是大腸埃希菌（30.6%）。 近年來，我國各地區(qū)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌分離率，一般在15%～35%左右［2］，2003年以來，部分城市已高達(dá)40%［3］。 本研究產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的分離率分別是37.5%， 25%，與全國水平相當(dāng)。 各地區(qū)對(duì)產(chǎn)ESBLs陰溝腸桿菌的分離率差異較大，佘丹陽等［4］在106株陰溝腸桿菌中發(fā)現(xiàn)單純產(chǎn)ESBLs占10.4%（11/106），肖慶忠等［5］報(bào)告陰溝腸桿菌產(chǎn)ESBLs達(dá)55.2%（117/212），本院陰溝腸桿菌產(chǎn)ESBLs率高達(dá)56.6%，與廣州地區(qū)相似，可能與本院菌株分布，用藥種類不同或存在局部流行有關(guān)。

　　我院多個(gè)科室中均分離到ESBLs菌，表明全院面臨產(chǎn)ESBLs菌感染的威脅，應(yīng)引起高度重視。 其中，ESBLs菌在神經(jīng)科最常見（32.7%）。 推測(cè)原因神經(jīng)科入住的危重患者多，第三代頭孢菌素使用量較大，在抗生素的選擇性壓力下，導(dǎo)致了ESBLs產(chǎn)生株增多。

　　PCR結(jié)果表明本院產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌主要產(chǎn)TEM型β內(nèi)酰胺酶，以大腸埃希菌和陰溝腸桿菌為主，其次是CTXM型，主要集中于陰溝腸桿菌。 本院SHV型β內(nèi)酰胺酶少見，主要由克雷伯菌屬產(chǎn)生。 產(chǎn)TEM型、CTXM型β內(nèi)酰胺酶在鮑曼不動(dòng)桿菌檢出，但不排除存在其他型別的可能。 李蓉等［6］檢測(cè)15株鮑曼不動(dòng)桿菌主要為 TEM 型、PER 型β 內(nèi)酰胺酶基因和 OXA23 型碳青霉烯酶基因。 本研究中三株銅綠假單胞菌均不含blaTEM， blaSHV， blaCTX，說明可能為其他型別，有待進(jìn)一步研究。 有報(bào)道，銅綠假單胞菌最常見為PER型［3］。 值得關(guān)注的是，本院產(chǎn)ESBLs菌TEM， SHV， CTX基因雙陽性的比率達(dá)34.7%，表明產(chǎn)ESBLs菌攜帶兩種β 內(nèi)酰胺酶耐藥基因是我院的流行特點(diǎn)。 其中，陰溝腸桿菌TEM型和CTXM型陽性占52.9%（17/9），多個(gè)耐藥基因的存在造成陰溝腸桿菌的耐藥譜擴(kuò)大［7］。 北京張永利等［8］在12株陰溝腸桿菌中檢出5株同時(shí)攜帶blaTEM， blaCTX，推測(cè)產(chǎn) ESBLs 菌可通過質(zhì)粒進(jìn)行細(xì)菌間耐藥基因的交換，同一菌株質(zhì)粒上有2種或2種以上ESBLs編碼基因。［醫(yī)學(xué)教　育網(wǎng) 搜集整理］

　　本研究我們發(fā)現(xiàn)CTXM型β內(nèi)酰胺酶在我院有流行，具有重要的意義。   國內(nèi)報(bào)道產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的基因型主要是CTXM型［9］，與我國頭孢噻肟用量多于其他三代頭孢菌素有關(guān)。 我院頭孢噻肟的用量也有此特點(diǎn)。 CTXM型ESBLs菌株可通過轉(zhuǎn)座子從染色體轉(zhuǎn)移至質(zhì)粒，并通過質(zhì)粒使耐藥性廣泛傳播，從而存在爆發(fā)流行的潛在性。 因此，臨床要避免濫用抗生素，重視細(xì)菌耐藥的檢測(cè)，控制耐藥菌株的傳播，減少醫(yī)院感染的發(fā)生。

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