【摘要】  探討蟾毒靈對(duì)裸鼠人肝癌原位移植模型的抗腫瘤作用及對(duì)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響。方法：建立裸鼠人肝癌原位移植模型，隨機(jī)分為蟾毒靈高（1.5 mg/kg）、中（1 mg/kg）、低（0.5 mg/kg）劑量治療組，阿霉素8 mg/kg治療組和模型組。裸鼠人肝癌原位移植模型第25天測(cè)量腫瘤體積，取瘤組織做HE染色觀察腫瘤壞死程度并行電鏡觀察，DNA原位末端標(biāo)記法檢測(cè)凋亡標(biāo)記指數(shù)，免疫組化法檢測(cè)肝癌組織中Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)。結(jié)果：蟾毒靈各劑量組腫瘤體積均較模型組明顯縮?。?P <0.01），生存期較阿霉素治療組及模型組延長(zhǎng) （ P < 0.05）。電鏡觀察到蟾毒靈各組腫瘤出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡征象，低、中、高劑量治療組的凋亡指數(shù)分別為5.87±2.13、8.86±2.96和10.60±3.42，明顯高于阿霉素治療組的3.28±0.98（ P <0.05或 P < 0.01）； 蟾毒靈各組瘤組織的Bax表達(dá)明顯增強(qiáng)，而B(niǎo)cl-2表達(dá)無(wú)明顯改變。結(jié)論：蟾毒靈對(duì)裸鼠人肝癌原位移植模型有明顯的抗腫瘤作用，其作用機(jī)制可能與上調(diào)Bax表達(dá)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

　　【關(guān)鍵詞】  蟾毒靈；肝癌；細(xì)胞凋亡；Bcl-2；Bax；裸小鼠

　　蟾毒靈（bufalin）是從中藥蟾酥中提取的一種毒性配基之一，分子式為C24H32O4，相對(duì)分子質(zhì)量為386.5.研究表明，蟾毒靈具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡的作用，主要涉及到白血病、前列腺癌、胃癌、肝癌等人類(lèi)腫瘤，且僅限于體外研究［1～4］。本文旨在探討蟾毒靈對(duì)人肝癌裸鼠原位移植模型的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)及對(duì)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響。

　　1 材料和方法

　　1.1 實(shí)驗(yàn)材料

　　1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和瘤株 BALB/C-nu/nu裸鼠，由復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，SCKK（滬）2003-0003，4～5周齡，體質(zhì)量18～20 g，雄性，在無(wú)特殊病原菌條件下分籠飼養(yǎng)。人肝癌細(xì)胞株BEL-7402，由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所提供，由第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院中醫(yī)科實(shí)驗(yàn)室傳代凍存。

　　1.1.2 藥物和試劑 蟾毒靈，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；阿霉素（adriamycin， ADM），深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；DNA原位末端標(biāo)記試劑盒，Boehringer Mannhein公司產(chǎn)品；鼠抗人Bcl-2和Bax蛋白單克隆抗體，Santa Cruz公司產(chǎn)品。

　　1.2 實(shí)驗(yàn)方法

　　1.2.1 模型分組及處理 參照文獻(xiàn)制作裸鼠人肝癌原位移植模型［5，6］，隨機(jī)分為蟾毒靈1.5、1.0和0.5 mg/kg治療組，ADM治療組和模型組，每組 15只。 各組均于造模后第15天用藥，蟾毒靈治療組分別腹腔注射，第15～24天，1次/d；模型組注射等體積的生理鹽水（normal saline， NS），方法同蟾毒靈組；ADM按8 mg/kg腹腔注射，僅在造模第 15天 給藥1次。停藥次日每組處死荷瘤鼠10只，用游標(biāo)卡尺分別測(cè)量瘤體的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），依據(jù)公式V=ab2/2計(jì)算腫瘤體積；抑瘤率（%）=［1-（V治療組/V模型組）］×100.每組剩余小鼠（5只）觀察生存期，計(jì)算生命延長(zhǎng)率。生命延長(zhǎng)率（%）=［（藥物組平均存活天數(shù)-NS組平均存活天數(shù)）/NS組平均存活天數(shù)］×100.

　　1.2.2 組織學(xué)及電鏡觀察 部分瘤組織用10%福爾馬林固定，石蠟切片，HE染色作常規(guī)病理檢查，觀察腫瘤組織壞死程度［7］。剩余瘤組織以3%戊二 醛固定1～3 h，緩沖液沖洗后，用1%四氧化鋨固定1～2 h，梯度丙酮脫水和Epon 812包埋，醋酸雙氧鈾與檸檬鉛雙染色、切片，電子染色，透射電鏡下觀察拍照。

　　1.2.3 DNA原位末端標(biāo)記檢測(cè) 采用TdT介導(dǎo)的帶生物素dUTP缺口末端標(biāo)記技術(shù)（terminal de-oxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling， TUNEL）檢測(cè)細(xì)胞凋亡指數(shù)［7］。以PBS代替TUNEL反應(yīng)液作為陰性對(duì)照，以細(xì)胞核有明顯棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞。每張切片觀察10個(gè)高倍視野，陽(yáng)性記數(shù)采用雙盲法，計(jì)數(shù)時(shí)避開(kāi)腫瘤壞死區(qū)，每100個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為標(biāo)記指數(shù)（label index， LI）。

　　1.2.4 Bcl-2和Bax蛋白的免疫組化檢測(cè) 采用過(guò)氧化酶標(biāo)記的鏈霉卵白素（streptavidin peroxidase， SP）法，DBA顯色，按照試劑說(shuō)明書(shū)的流程進(jìn)行檢測(cè)。在光鏡下觀察，以胞漿內(nèi)棕黃色細(xì)顆粒為Bcl-2和Bax陽(yáng)性染色，細(xì)胞計(jì)數(shù)方法同TUNEL檢測(cè)。

　　1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用 x ±s 表示，進(jìn)行單因素方差分析。

　　2 結(jié)果

　　2.1 荷瘤裸鼠體質(zhì)量及腫瘤變化 治療前各組腫瘤大小差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P >0.05），提示各組瘤體大小具有可比性。與模型組相比，裸鼠人肝癌原位移植模型經(jīng)蟾毒靈和ADM治療后瘤體均明顯縮?。?P <0.01），蟾毒靈高劑量治療組的抑瘤率高于ADM治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05）；蟾毒靈治療前后各組裸鼠的體質(zhì)量無(wú)明顯改變（ P > 0.05）。 見(jiàn)表1.

　　2.2 平均生存期及生命延長(zhǎng)率 蟾毒靈治療后各組裸鼠的平均生存期均有所延長(zhǎng)，蟾毒靈高、中、低劑量治療組生命延長(zhǎng)率分別為35.9%、29.9%和17.1%，蟾毒靈各組與模型組生存時(shí)間相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05），以蟾毒靈高劑量治療組最為明顯，而ADM治療組裸鼠生存期未見(jiàn)延長(zhǎng)。見(jiàn)圖1.

　　2.3 肝腫瘤壞死程度 治療后，模型組瘤組織呈輕度壞死，蟾毒靈高、中劑量治療組和ADM治療組癌灶內(nèi)有大量纖維結(jié)締組織增生，肝癌組織以中重度壞死為主。但壞死灶主要集中在腫瘤中央部位，肝癌細(xì)胞在癌灶邊緣生長(zhǎng)仍較為活躍。見(jiàn)圖2.

　　2.4 肝癌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu) 模型組癌細(xì)胞表面不規(guī)則，核大呈圓形，染色質(zhì)增多，游離核糖體較多，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)較豐富的線(xiàn)粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。蟾毒靈各治療組?？梢?jiàn)細(xì)胞核固縮的肝癌細(xì)胞，胞漿濃縮，染色質(zhì)濃集于核膜內(nèi)側(cè)呈團(tuán)塊或新月?tīng)?，胞漿起泡和凋亡小體，并見(jiàn)凋亡小體脫離細(xì)胞體，沒(méi)入間質(zhì)或被其他 細(xì)胞吞飲。

　　2.5 瘤組織凋亡標(biāo)記指數(shù)及Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá) 蟾毒靈治療組肝癌細(xì)胞的凋亡指數(shù)分別明顯高于模型組，ADM治療組凋亡指數(shù)未見(jiàn)明顯增加。蟾毒靈治療組Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均有所降低，表達(dá)強(qiáng)度較弱，但與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；瘤組織均見(jiàn)Bax蛋白高表達(dá)，Bax蛋白表達(dá)標(biāo)記指數(shù)隨著蟾毒靈劑量的增加而提高。見(jiàn)表2、圖3.

　　表1 裸鼠人肝癌原位移植模型蟾毒靈治療前后體質(zhì)量及瘤體變化（略）

　　Table 1 Changes of mouse body weight and tumor volume of human hepatocellular orthotopically transplanted tumor induced by bufalin

　　*P <0.05， vs ADM-treated group；△△P <0.01， vs NS-treated group.

　　圖1 各組平均生存時(shí)間（略）

　　Figure 1 Mean survival time of five groupsBu1： High-dose bufalin-treated group； Bu2： Medium-dose bufalin-treated group； Bu3： Low-dose bufalin-treated group；*P <0.05， vs NS-treated group； n =5.

　　圖2 瘤組織壞死程度的病理形態(tài)（HE染色， ×250）（略）

　　Figure 2 Pathological characteristics of tumor necrosis （HE staining， ×250）A： NS-treated group； B： High-dose bufalin-treated group.

　　表2 肝癌組織細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Bax表達(dá)的標(biāo)記指數(shù)（略）

　　Table 2 Label index of tumor cell apoptosis and expressions of Bcl-2 and Bax in tumor tissues

　　*P <0.05，**P <0.01， vs NS-treated group.

　　圖3 裸鼠原位肝內(nèi)移植瘤Bax蛋白的表達(dá)（SP法， ×200）（略）

　　Figure 3 Expression of Bax in orthotopically transplanted tumor of human hepatocellular carcinoma in nude mice （SP method， ×200）

　　A： Bax expressed weakly in NS-treated group. B： High expression in high-dose bufalin-treated group.

　　3 討論

　　蟾酥及其相關(guān)制劑一直是臨床治療肝癌最有效的中藥之一［8］。蟾酥的化學(xué)成分復(fù)雜，通過(guò)對(duì)蟾酥的分離和鑒定，主要的化學(xué)成分已得到部分確認(rèn)［9，10］。蟾毒靈是從中藥蟾酥中提取的毒性配基之一，屬于細(xì)胞拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制劑。蟾毒靈對(duì)血液腫瘤、前列腺癌、胃癌等人類(lèi)腫瘤的抑制作用已有報(bào)道，但未見(jiàn)有對(duì)人肝癌細(xì)胞的體內(nèi)研究報(bào)道。在對(duì)蟾毒靈抗腫瘤的前期研究中發(fā)現(xiàn)蟾毒靈在體外對(duì)人肝癌SMMC-7721和BEL-7402細(xì)胞株具有較強(qiáng)的殺傷作用，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期G2/M期阻滯，這可能是蟾毒靈抗肝癌的作用機(jī)制［4，11］，但蟾毒靈在體內(nèi)抗人肝癌的作用仍不清楚。蟾毒靈對(duì)小鼠的LD50為2.2 mg/kg［12］，本實(shí)驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)2 mg/kg的一次性給藥劑量就可使小鼠發(fā)生一過(guò)性的痙攣性抽搐，但未引起小鼠中毒性死亡。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)主要研究給予1.5 mg/kg及以下劑量蟾毒靈時(shí)動(dòng)物體內(nèi)的抗腫瘤作用。人類(lèi)腫瘤裸鼠原位移植瘤模型是抗癌藥物篩選和機(jī)制研究較為理想的動(dòng)物模型，我們成功建立了裸鼠人肝癌原位移植模型，在此基礎(chǔ)上觀察蟾毒靈對(duì)裸鼠原位人肝癌移植模型的抗腫瘤效果，結(jié)果表明蟾毒靈按總量15、10和5 mg/kg分10 d連續(xù)給藥治療裸鼠原位人肝癌移植性模型在瘤體縮小方面具有與阿霉素8 mg/kg相同的療效，且在帶瘤生存期的延長(zhǎng)及模型生活質(zhì)量（體質(zhì)量的增減）的改善方面，蟾毒靈各治療組明顯優(yōu)越于阿霉素治療組。提示蟾毒靈在體內(nèi)具有良好的抗肝癌作用。病理學(xué)及TUNEL檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高、中劑量蟾毒靈不僅能導(dǎo)致肝癌組織中、重度壞死及大量纖維結(jié)締組織增生，而且能原位誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，凋亡標(biāo)記指數(shù)與蟾毒靈給藥呈劑量依賴(lài)性。細(xì)胞凋亡是由于細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境變化或死亡信號(hào)觸發(fā)以及在基因調(diào)控下所引起的細(xì)胞主動(dòng)死亡的過(guò)程。Bcl-2基因家族是細(xì)胞凋亡研究中最受重視的基因，目前已發(fā)現(xiàn)幾個(gè)與Bcl-2同源的基因，包括Bcl-xL、Bcl-xs、Bax、Bak、mcl-1、A1、Bag-1、Bfl-1、ced9、BHRF-1等，構(gòu)成了Bcl-2家族。其中Bax基因是Bcl-2家族中的一員，其生物學(xué)作用是拮抗Bcl-2，與Bcl-2形成二聚體，抑制或促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl-2和Bax的比例決定細(xì)胞的凋亡狀態(tài)：Bcl-2表達(dá)水平高于Bax時(shí)，Bcl-2和Bcl-2形成同源二聚體，細(xì)胞凋亡受抑制；Bax表達(dá)水平高于Bcl-2時(shí)，則形成Bax-Bax同源二聚體，細(xì)胞凋亡增強(qiáng)［13］。有資料顯示，Bcl-2蛋白在肝癌組織和肝癌細(xì)胞系中，一般只呈低水平的表達(dá) 或不表達(dá)，而B(niǎo)ax蛋白則呈較高水平的表達(dá)［14］。本研究中裸鼠人肝癌原位移植瘤的免疫組化結(jié)果顯示，Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率僅為9.05%，而B(niǎo)ax蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為31.25%，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致。蟾毒靈治療后均未見(jiàn)瘤組織Bcl-2表達(dá)率的明顯變化，而B(niǎo)ax表達(dá)卻明顯提高，瘤組織Bax蛋白陽(yáng)性標(biāo)記指數(shù)與凋亡標(biāo)記指數(shù)有正相關(guān)趨勢(shì)（ r =0.876 8），提示上調(diào)Bax蛋白表達(dá)、誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡可能是蟾毒靈體內(nèi)抗肝癌的機(jī)制之一。

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