首先協(xié)助患者側臥于病床上，背部與床面垂直。頭向前胸部屈曲，雙手抱膝緊貼腹部，使軀干呈弓形。

然后確定穿刺部位：一般取“雙側髂嵴最高點的連線”與“后正中線”的交點，即：第3～4腰椎棘突間隙作為進針部位。（也可上移或下移一個腰椎間隙）

完成上述步驟后，戴無菌手套，常規(guī)消毒皮膚2～3遍；消毒時以穿刺點為圓心，由內向外，消毒直徑15cm的區(qū)域；

消毒后，覆蓋無菌洞巾，選取2%利多卡因做局部浸潤麻醉，先在穿刺點斜行進針，在皮下打一小皮丘，然后垂直緩慢進針，直至椎間韌帶逐層麻醉。

局部浸潤麻醉后，以左手固定穿刺點皮膚，右手持穿刺針，垂直背部緩慢刺入。進針深度成人約4～6cm（兒童則為2～4cm）。當針鋒抵抗感突然消失時，表明針頭已穿過硬脊膜，此時將針芯慢慢抽出，可見腦脊液流出；

然后連接測壓管，測量腦脊液壓力。正常情況下，側臥位腦脊液壓力為70～180mmH2O（或40～50滴／分鐘）。

撤去測壓管，將針芯插入穿刺針，再根據檢測要求收集適量腦脊液送檢。

最后，緩慢拔出穿刺針，用無菌紗布覆蓋按壓穿刺點3～5分鐘，并用膠布固定。

穿刺結束后，囑咐患者去枕平臥（也可取俯臥位）休息4～6小時，以避免引起低顱壓性頭痛。