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堿性苦味酸速率法測定的原理是肌酐同堿性苦味酸反應(yīng)形成一種紅色復(fù)合物，通常在510nm處根據(jù)測定一定時(shí)間內(nèi)血清和標(biāo)準(zhǔn)液吸光度的增加量計(jì)算肌酐的含量。而膽紅素在510nm處也有較強(qiáng)光吸收，并且在氫氧化鈉的作用下，逐漸轉(zhuǎn)化為620nm處有強(qiáng)光吸收的膽綠素，而膽綠素在520nm處只有很弱的光吸收，這樣就掩蓋了肌酐本身的顯色反應(yīng)的表現(xiàn)，從而使測定結(jié)果偏低，甚至出現(xiàn)負(fù)值。

經(jīng)過查閱有關(guān)文獻(xiàn)和多次實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)膽紅素在37℃和強(qiáng)堿環(huán)境下被氧化成膽綠素，導(dǎo)致510nm處吸光度減少的時(shí)間為兩者混合后50s以內(nèi)，50s以后510nm吸光度下降緩慢或基本不變。我們根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)并結(jié)合BECKMAN-CX5型全自動(dòng)生化分析儀的特點(diǎn)，將原來的雙液體試劑反應(yīng)步驟進(jìn)行了改進(jìn)，把原來的一步法改為兩步法。這種改進(jìn)后的方法可以有效地消除膽紅素對肌酐測定的負(fù)影響。

1材料與方法

1.1試劑堿性苦味酸試劑

由上海豐匯醫(yī)學(xué)科技公司提供。肌酐標(biāo)準(zhǔn)液、高、中、低定值質(zhì)控血清：美國進(jìn)口。儀器：BECKMAN-CX5型全自動(dòng)生化分析儀。

1.2方法

20l血清與200l試劑R1混合后，連續(xù)檢測該混合物分別在520nm和620nm處吸光度的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)48s以后520nm吸光度下降緩慢或基本不變，而620nm處吸光度在32s后上升緩慢或基本不變。膽紅素被氧化成膽綠素的反應(yīng)主要發(fā)生在標(biāo)本和RI液混合后50s以內(nèi)。

根據(jù)上述發(fā)現(xiàn)并結(jié)合BECKMAN-CX5型全自動(dòng)生化分析儀的特點(diǎn)，調(diào)整后的反應(yīng)參數(shù)。20l血清與200l試劑R1反應(yīng)16s后加入50l試劑R2，在試劑R2加入后16s讀取起始吸光度，再過48s讀取終末吸光度，計(jì)算時(shí)用A2-A1=A，肌酐的含量為：肌酐=樣品A/標(biāo)準(zhǔn)A標(biāo)準(zhǔn)濃度。主波長520nm，副波長560nm，反應(yīng)溫度37℃。

2結(jié)果

2.1兩種方法的比較選取膽紅素和肌酐正常參考值范圍的低值定值質(zhì)控血清，分別用一步法和兩步法在BECKMAN-CX5型全自動(dòng)生化分析儀各連續(xù)測定測定肌酐濃度20次，一步法測定結(jié)果：x=45.8mol/L，s=2.231，CV=4.9%；兩步法測定結(jié)果x=47.0mol/L，s=2.066，CV=4.4%.經(jīng)配對t檢驗(yàn)，t=1.9880.05，兩者無明顯差異，并且二者測定結(jié)果都接近靶值。再取一定量的高值定值質(zhì)控血清，在BECKMAN-CX5型全自動(dòng)生化分析儀分別用一步法和兩步法連續(xù)測定肌酐20天。一步法測定結(jié)果由于受膽紅素的影響，肌酐濃度明顯降低。而兩步法膽紅素對其影響不大與質(zhì)控血清肌酐定值接近。配對t檢驗(yàn)，t=8.37t，P＜0.05，兩者有明顯差異。

2.2方法的精確性

本方法低、中、高三種質(zhì)控血清批內(nèi)變異系數(shù)依次為4.8%、2.94%、0.84%，批間CV依次為3.79%、2.06%、1.52%，精密度良好。

2.3回收實(shí)驗(yàn)

取3份膽紅素在117mol/L的血清做試驗(yàn)，分別加入肌酐的濃度為40.9mol/L、20.3mol/L、10.6mol/L做肌酐測定回收試驗(yàn)，測得回收濃度分別為38.9mol/L、19.3mol/L、10.7mol/L回收率依次為95.1%、95.2%、103.8%.3討論苦味酸速率法測定肌酐時(shí)，受高膽紅素負(fù)干擾而致結(jié)果明顯偏低，甚至出現(xiàn)負(fù)值。常用消除干擾方法有強(qiáng)堿法、表面活性劑法、氧化劑法、膽紅素氧化酶法、補(bǔ)償修飾、在部分機(jī)型上應(yīng)用速率B法。

預(yù)處理法，由于添加了其他成分，操作不可避免地顯得冗長、繁瑣，另一方面因?yàn)楦郊映煞值慕槿耄茐牧嗽蟹磻?yīng)體系，可能又會引起新的干擾。速率B法對儀器要求高而難以普及應(yīng)用。而酶法測定肌酐由于價(jià)格的關(guān)系，目前只被國內(nèi)少數(shù)醫(yī)院接受，難以普及。本方法沒有添加任何成分，原有的反應(yīng)體系沒有改變，所以方法學(xué)評價(jià)和原方法一致，并且可以有效地消除膽紅素對肌酐測定的干擾，對膽紅素400mol/L的標(biāo)本用生理鹽水稀釋1倍進(jìn)行測試效果較好。該方法簡單、方便、準(zhǔn)確，適合臨床推廣。