1.色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

色譜柱：島津VP-ODS c柱（250mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）一0.2%磷酸溶液（B）（A+B=100%）作梯度洗脫， t=0—6 min，A：27%；t=6—10 min，A：30%；t=10—15 min. A：60%；15—25 min，A：90%；流速：1.O mL/min；檢測波長：278 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量20μl.在上述色譜條件下，4種待測組分與鄰近組分達(dá)到了基線分離，理論塔板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算不低于3 000。

2.溶液的制備

2.1對(duì)照品溶液的制備精密稱取綠原酸、黃芩苷、連翹苷和漢黃芩素對(duì)照品適量，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別制成濃度為1.10、1.03、0.51、0.44 mg/mL的對(duì)照品母液。

2.2供試品溶液的制備精密吸取雙黃連口服液1.0 mL，置50 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，0.45 um微孔濾膜過濾，即得。

2.3 陰性對(duì)照溶液的制備按處方比例及制備工藝，分別制備缺金銀花、黃芩、連翹的陰性對(duì)照樣品，按供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。

3.線性關(guān)系考察

分別精密吸取綠原酸對(duì)照品母液0.20、o.40、0.75、1.50、3.O mL，黃芩苷對(duì)照品母液0.25、0.50、1.O、2.0、3.0mL，連翹苷對(duì)照品母液0.20、0.40、0.60、1.20、2.0漢黃芩素對(duì)照品母液0.15、o.25、0.50、1.0、2.0 IfIL，對(duì)應(yīng)加入10 IIlL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成5個(gè)濃度的混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以峰面積為縱度標(biāo)，分別以綠原酸、黃芩苷、連翹苷和漢黃芩素進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。綠原酸：Y=1.04×loX+1.40×10，R=0.999 6；黃芩苷：y=3.87×106X——I.26*104，，=0.999 9；連翹苷：Y=6.44×lOSX+1.74×10 ，R=0.9999；漢黃芩素：Y=6.30×IO~X+1.45×lOs，r=O.9999結(jié)果表明，綠原酸進(jìn)樣量在0.44～6.60 μg范圍內(nèi)，黃芩苷進(jìn)樣量在0.52～6.18μg范圍內(nèi)，連翹苷進(jìn)樣量在o.20～2.04μg范圍內(nèi)，漢黃芩素進(jìn)樣量在o.13～1.76 μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

精密吸取綠原酸、黃芩苷、連翹苷和漢黃芩素混合對(duì)照品溶液注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣5次，綠原酸峰面積RSD：1.12%，黃芩苷峰面積RSD=O.86%，連翹苷峰面積RSD=O.72%漢黃芩素峰面積RSD=0.58%。結(jié)果表明，所選方法精密度良好。

4.穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液，分別在O、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣，測定樣品中綠原酸、黃芩苷、連翹苷和漢黃芩素的峰面積，結(jié)果綠原酸RSD=l_74%，黃芩苷RSD=2.04%，連翹苷RSD=1.81%，漢黃芩素RSD=2.38%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

5.重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批號(hào)5份樣品，按供試品溶液制備方法制備，進(jìn)樣，記錄峰面積，結(jié)果綠原酸RSD=1.48%，黃芩苷RSD=1.53%，連翹苷RSD=1.34%，漢黃芩素RSD=1.58%，表明方法重復(fù)性良好。

6.陰性對(duì)照試驗(yàn)

分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，繪制色譜圖。結(jié)果陰性對(duì)照潮液在供試品溶液及對(duì)照品溶液中綠原酸、黃芩苷、連翹苷和漢黃芩素保留時(shí)間相應(yīng)位置上均無吸收峰出現(xiàn)，表明陰性對(duì)照無干擾。

7.加樣回收率試驗(yàn)

精密量取同一批號(hào)0.2 mL雙黃連口服液4份于50 mL祠量瓶中，分別加入綠原酸、黃芩苷、連翹苷和漢黃芩素對(duì)照品溶液適量，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，0.45μ微孔濾膜過濾。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定其含量，計(jì)算加樣回收率。