方法名稱： 門冬酰胺酶原料藥—效價測定—分光光度法

應(yīng)用范圍： 本方法采用分光光度法測定門冬酰胺酶原料藥中門冬酰胺酶的效價。

本方法適用于門冬酰胺酶原料藥。

方法原理： 供試品經(jīng)前處理后，置紫外可見分光光度計，于450nm波長處測定吸收度，計算出其效價。

試劑： 1. 磷酸鹽緩沖液

2. 門冬酰胺

3. 25%三氯醋酸溶液

4. 碘化汞鉀溶液

儀器設(shè)備： 紫外可見分光光度計

試樣制備： 1. 磷酸鹽緩沖液：取0.1mol/L磷酸氫二鈉溶液適量，用0.1mol/L磷酸二氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0。

2.碘化汞鉀溶液：取碘化汞23g、碘化鉀16g，加水至100mL，臨用前以20%氫氧化鈉溶液等體積混合。

3.對照品溶液的制備：取經(jīng)105℃干燥至恒重的硫酸銨適量，精密稱定，用水制成0.0015mol/L的溶液。

4. 供試品溶液的制備：精密稱取供試品約0.1g，用磷酸鹽緩沖液制成每1mL中含門冬酰胺酶約5單位的溶液，即得供試品溶液。

注：“精密稱取”系指稱取重量應(yīng)準(zhǔn)確至稱取重量的千分之一。“精密量取”系指量取體積的準(zhǔn)確度應(yīng)符合國家標(biāo)準(zhǔn)中對該體積移液管的精度要求。

操作步驟： 取試管3支（14cm×1.2cm），各加入用上述磷酸鹽緩沖液配制的0.33%門冬酰胺溶液1.9mL，于預(yù)熱3分鐘，分別于第一管（t0）中加入25%三氯醋酸溶液0.5mL，第2、3管（t）中各精密加入供試品溶液0.1mL，置37℃水浴中，準(zhǔn)備反應(yīng)15分鐘，立即于第一管（t0）中精密加入供試品溶液0.1mL，第2、3管（t）中各加入25%三氯醋酸溶液0.5mL，搖勻，分別作為空白反應(yīng)液（t0）和反應(yīng)液（）。精密量取t0、t和對照品溶液各0.5mL置試管中，各加水7.0mL及碘化汞鉀溶液1.0mL，混勻，另取試管一支，加水7.5mL及碘化汞鉀溶液1.0mL作為空白對照管，室溫放置15分鐘，照紫外分光光度法，于波長450nm處測定吸收度A0、At和As，以At的平均值計算。

注：分光光度法應(yīng)以配制供試品的同批溶劑為對照，采用1cm的石英吸收池。以吸收度最大的波長作為測定波長，一般供試品的吸收度讀數(shù)，以在0.3-0.7之間的誤差較小。儀器的狹縫波帶寬度應(yīng)小于供試品吸收帶的半寬度，否則測得的吸收度偏低。狹縫寬度的選擇，應(yīng)以減少狹縫寬度時供試品的吸收度不再增加為準(zhǔn)。由于吸收池和溶劑本身可能有空白吸收，因此測定供試品的吸收度后應(yīng)減去空白讀數(shù)，再計算含量。