（一）配料

按培養(yǎng)基處方準(zhǔn)確稱取各種成分，先在三角燒瓶中加入少量蒸餾水，再加入各種成分，以防蛋白胨等粘附于瓶底，然后再以剩余的水沖洗瓶壁。

（二）溶化

將各種成分混勻于水中，最好以流通蒸氣溶化半小時(shí)，如在電爐上溶化應(yīng)隨時(shí)攪拌，如有瓊脂成分時(shí)更應(yīng)注意防止外溢。溶化完畢，補(bǔ)足失去的水分。

（三）矯正pH

1.pH測定

取與標(biāo)準(zhǔn)管同口徑的試管（通常用華氏試管）3支，于第1、3管各加入欲測定pH的的培養(yǎng)基5ml，并于第一管中加入0.2g／L的酚紅0.25ml作為測定管，混勻；于第2管加入蒸餾水5ml，第4管為pH標(biāo)準(zhǔn)比色管。

2.pH的校正

若測定管過酸或過堿可用0.1mol／L氫氧化鈉或0.1mol／L鹽酸溶液矯正，直至顏色與標(biāo)準(zhǔn)管相同為止，加堿或加酸時(shí)要精確緩慢，每加1滴后要充分混勻，比色后再加第2滴（有時(shí)僅加半滴）準(zhǔn)確記錄加入的量。

3.計(jì)算

設(shè)5ml培養(yǎng)基矯正pH至7.4時(shí)需0.1mol／L氫氧化鈉0.15ml，現(xiàn)有培養(yǎng)基4990ml，需加氫氧化鈉的量可按下列方法計(jì)算：5∶4990＝0.15∶X

X＝0.15×4990/5＝149.7（ml）

如將此0.1mol／L的氫氧化鈉改用1mol／L的氫氧化鈉時(shí)，則需14.9ml即可。

（四）過濾澄清

培養(yǎng)基配制后一般都有沉渣或混濁出現(xiàn)，需過濾成清晰透明后方可使用，常用的過濾方法如下：

1.液體培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基必須清晰，以便觀察細(xì)菌的生長情況，常用濾紙過濾，亦可在加熱前加入用水稀釋的雞蛋白（1000ml培養(yǎng)基用1個(gè)雞蛋白）在100℃加熱后保持60～70℃40～

60分鐘，使其不溶性物質(zhì)附于凝固的蛋白上而沉淀，然后再用虹吸法吸出上清液或以濾紙過濾。

2.固體培養(yǎng)基

如系瓊脂培養(yǎng)基，于加熱融化后需趁熱以絨布或兩層紗布中夾脫脂棉過濾；亦可用

自然沉淀法，即將瓊脂培養(yǎng)基盛人鋁鍋或廣口搪瓷容器內(nèi)，以高壓（103.43kPa）蒸汽融化15分鐘后，靜置高壓鍋內(nèi)過夜，次日將瓊脂傾出，用刀將底部沉渣切去，再融化即可收清晰的瓊脂培養(yǎng)基。

（五）分裝

1.根據(jù)需要將培養(yǎng)基分裝于不同容量的三角燒瓶、試管中。分裝的量不宜超過容器的2／3以免滅菌時(shí)外溢。

2.瓊脂斜面分裝量為試管容量的1／5，滅菌后須趁熱放置成斜面，斜面長約為試管長的2／3.

3.半固體培養(yǎng)基分裝量約為試管長的1／3，滅菌后直立凝固待用。

4.高層瓊脂分裝量約為試管的1／3，滅菌后趁熱直立，待冷后凝固待用。

5.液體培養(yǎng)基分裝于試管中，約是試管長度的1／3.

6.瓊脂平板：將滅菌（或加熱融化）后的培養(yǎng)基冷至50℃左右，以無菌手續(xù)傾人滅菌平皿內(nèi)，內(nèi)徑9cm的平皿傾注培養(yǎng)基約13～15ml，輕搖平皿底，使培養(yǎng)基平鋪于平皿底部，待凝固后即成，傾注培養(yǎng)基時(shí)，切勿將皿蓋全部啟開，以免空氣中塵埃及細(xì)菌落入。

新制成的平板培養(yǎng)基（簡稱平板），表面水分較多，不利于細(xì)菌的分離，通常應(yīng)將平皿倒扣擱置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)約30分鐘待平板平面干燥后使用。

（六）滅菌

不同成分、性質(zhì)的培養(yǎng)基，可采用不同的滅菌方法。高壓蒸汽滅菌法：高壓滅菌的溫度與時(shí)間隨培養(yǎng)基的種類及數(shù)量的不同有所差別，

一般培養(yǎng)基少量分裝時(shí)高壓（103.43kPa）滅菌15分鐘即可，培養(yǎng)基分裝量較大時(shí)，可高壓（103.43kPa）滅菌30分鐘，含糖的培養(yǎng)基高壓（55.16kPa）滅菌15分鐘。以免糖類被破壞。

（七）檢定

每批培養(yǎng)基制成后須經(jīng)檢定方可使用，檢定時(shí)將培養(yǎng)基放37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)后，證明無菌，同時(shí)用已知菌種檢查在此培養(yǎng)基上生長繁殖及生化反應(yīng)情況，符合要求者方可使用。

（八）保存

制好的培養(yǎng)基，不宜保存過久，以少量勤做為宜。每批應(yīng)注明名稱，分裝量，制作日期等，放在4℃冰箱內(nèi)備用。