隨著生物技術(shù)的發(fā)展,核酸檢測得到了人們越來越多的重視,它可直接檢查HIV RNA,可在發(fā)現(xiàn)血清學(xué)變化之前檢測HIV感染,而且比P24抗原檢測方法更靈敏[16]。

多聚酶鏈反應(yīng)檢測法

PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性—退火—延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。

① 模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93 ℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備。

② 模板DNA與引物的退火(復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55 ℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合。

③ 引物的延伸：DNA模板—引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成1條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性—退火—延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成1個循環(huán)需2～4 min， 2～3 h就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。檢測HIV?RNA,需要先利用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，繼而以cDNA為模板進行PCR擴增即可，這樣的反應(yīng)稱為RT－PCR。

實時熒光定量PCR技術(shù)

實時熒光定量PCR技術(shù),是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團,利用熒光信號實時監(jiān)測整個PCR進程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。

本技術(shù)的原理是使用熒光基團標(biāo)記探針,5′端標(biāo)記熒光基團R,3′端標(biāo)記淬滅基團Q,在沒有PCR擴增時,由于熒光基團和淬滅基團空間距離很近,使熒光基團被淬滅,不發(fā)熒光;而當(dāng)PCR擴增時,引物與熒光標(biāo)記的特異性探針同時結(jié)合在模板上,熒光標(biāo)記的探針與模板的結(jié)合位置位于上下游引物之間,利用Taq酶的5′?3′外切酶活性,將熒光探針?biāo)?熒光基團被釋放出來,由于在空間上與淬滅基團分開,則發(fā)出熒光。發(fā)出的熒光可以被熒光探頭檢測到,一邊擴增,一邊檢測,這樣就實現(xiàn)了“實時”檢測。該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從半定量到定量的飛躍,而且與常規(guī)PCR相比,它具有特異性強、自動化程度高、有效解決了PCR污染問題等特點[17]。

支鏈DNA檢測法——bDNA

bDNA是定量檢測血漿中的HIV?1型RNA的一種方法。bDNA是指人工合成的帶有側(cè)鏈的DNA片段,在其每個側(cè)鏈上都可以標(biāo)記被激發(fā)的標(biāo)記物。將HIV的RNA通過離心從病毒顆粒中釋放出來,然后用捕獲探針1將其捕獲到微孔中。捕獲探針2與病毒RNA的另一部分特異結(jié)合,又與預(yù)放大探針結(jié)合。后者再與放大探針即bDNA探針雜交。兩套靶探針分別與病毒RNA的pol基因的不同區(qū)域特異結(jié)合。在微孔中形成了HIVRNA?寡核苷酸復(fù)合物。再加入1種化學(xué)發(fā)光底物孵育后可放大化學(xué)發(fā)光信號。通過發(fā)光強度來定量,因為發(fā)光強度與樣品中HIVRNA含量成比例。bDNA不存在擴增物的交叉污染,這較PCR是一大進步。bDNA有數(shù)十個覆蓋整個基因組的探針,可以方便地檢測HIV某些變異株,但靈敏度不及PCR，提高bDNA靈敏度是一大難點[18]。

核酸序列依賴性擴增法(nucleic acid sequence based amplification, NASBA) NASBA是由一對引物介導(dǎo)的、連續(xù)均一的、體外特異性核苷酸序列等溫擴增RNA的新技術(shù)。反應(yīng)在 42 ℃進行 ,可在 2 h內(nèi)將RNA模板擴增約 109倍。NASBA原理是提取病毒RNA,加入AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶H、T7RNA聚合酶和引物進行擴增[15]。整個反應(yīng)分非循環(huán)相和循環(huán)相:在非循環(huán)相中,引物I與模板RNA退火后在AMV逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA,形成RNA:DNA雜合體,隨即RNaseH降解RNA,引物Ⅱ與cDNA退火, 在反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成第2條DNA互補鏈。雙鏈DNA可在T7RNA聚合酶的作用下,經(jīng)其啟動子序列起動而轉(zhuǎn)錄RNA，RNA又可在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)錄成DNA，進入循環(huán)相,對模板進行大量擴增。

轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增技術(shù)(transcription mediated amplification, TMA)TMA技術(shù)原理與NASBA基本一致，略有不同之處是TMA利用的是MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶及T7 RNA聚合酶兩種酶，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶既有逆轉(zhuǎn)錄酶的活性又具有RNA酶H活性。反應(yīng)在 41.5 ℃進行 ,可在 1 h內(nèi)將RNA模板擴增約 109倍。

連接酶酶促鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)

LCR是基于靶分子依賴的寡核苷酸探針相互連接的一種探針擴增技術(shù)，是繼PCR后新發(fā)展的一種較有前景的體外擴增技術(shù)。它的原理就是由2段寡核苷酸單鏈DNA探針與目標(biāo)序列雜交,當(dāng)該2段DNA探針與沒有發(fā)生突變的模板褪火后,如果2探針是緊鄰的,中間沒有核苷酸間隔,則可在連接酶作用下連接起來,連接以后的新鏈又可以作為模板,引導(dǎo)下一周期的連接產(chǎn)生新的子鏈。若連接區(qū)段發(fā)生核苷酸的堿基突變,則連接反應(yīng)不能發(fā)生,擴增反應(yīng)終止。