【關鍵詞】  神經干細胞；培養(yǎng)鑒定；移植

　　0引言

　　神經干細胞（neural stem cells， NSCs）在臨床應用中有廣闊的前景，對它的研究一直是近年來的熱點，現(xiàn)對NSCs的生物學特性，培養(yǎng)鑒定以及在中樞神經系統(tǒng)退行性疾病，缺血損傷和腫瘤治療等方面的研究進展做一概述。

　　1NSCs的存在部位和生物學特性

　　1.1存在部位在哺乳類動物胚胎期的紋狀體、海馬、腦皮層、視網膜、脊髓、嗅球、側腦室的腦室區(qū)、室下區(qū)均發(fā)現(xiàn)有NSCs存在，成年后，NSCs主要存在于嗅球、皮層、側腦室及脊髓的室管膜、部分室管膜下區(qū)和海馬齒狀回等部位。 目前已明確，成年哺乳動物腦內的側腦室腦室下區(qū)（svz）和海馬結構的顆粒下區(qū)（SGz） 可產生大量的神經元［1］。

　　1.2生物學特性NSCs具有無限的增殖分裂能力，它的主要生物學特征包括：具有多向分化潛能，能分化成本系大部分類型的細胞即神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞；具有自我更新和自我維持的能力。 NSCs通過兩種細胞分裂方式，即不對稱分裂和對稱分裂。 不對稱分裂時由于啟動了某種細胞機制，使細胞質中調節(jié)分化的蛋白質不均勻地分配而分裂產生一個新的干細胞和一個祖細胞，通過這種分裂方式產生一系列分化程度不同的子代細胞，以滿足神經細胞多樣性的需求。 一次對稱分裂產生兩個干細胞或兩個祖細胞。 祖細胞僅具有單向或雙向分化能力或其干細胞特性只能維持較短的時間［2］。 在多數情況下，成體干細胞分化為與其組織來源一致的細胞，但是在某些情況下，成體干細胞的分化并不遵循該規(guī)律，表現(xiàn)出很強的跨系或跨胚層分化潛能。 Galli等［3］將從人胚胎和成年小鼠分離的NSCs與骨骼肌的成肌細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)NSCs可分化為骨骼肌細胞，用胚胎和成年的NSCs以及體外克隆的NSCs移植給亞致死劑量照射的小鼠，結果證明NSCs可轉化為造血細胞。

　　2NSCs的培養(yǎng)和鑒定

　　2.1NSCs的培養(yǎng)目前的NSCs多采用無血清細胞培養(yǎng)和細胞克隆技術分離。 培養(yǎng)液在使用合成培養(yǎng)基的基礎上添加谷酰胺、胰島素、轉鐵蛋白、黃體酮、腐胺和具有絲裂原作用的生長因子（如EGF， bFGF等）。 待原代克隆形成后挑選單個克隆機械分離繼續(xù)進行亞克隆培養(yǎng)，也可采用單細胞克隆分離。 干細胞在無血清培養(yǎng)液中生長時呈懸浮球形，不貼壁也不生長突起，改變培養(yǎng)液（有血清培養(yǎng)液）后貼壁分化為成熟神經細胞。 有研究表明，在瓊脂糖抗貼壁培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)神經干細胞有利于神經干細胞持續(xù)增殖并保持未分化狀態(tài)，培養(yǎng)3 mo，神經干細胞的分化率僅為0.64%，而塑料培養(yǎng)瓶的分化率為32.05%，提示瓊脂糖抗貼壁培養(yǎng)法適合神經干細胞在體外長期、大量擴增［4］。 此外，星形膠質細胞與NSCs共培養(yǎng)時，神經干細胞貼壁分化加快，神經元特異性烯醇化酶（NSE）陽性細胞及酪氨酸羥化酶（TH）陽性細胞明顯多于NSCs單獨培養(yǎng)組，提示星形膠質細胞可快速誘導神經干細胞向神經元細胞分化［5］。

　　2.2NSCs鑒定標志物［6］現(xiàn)在NSCs還沒有特異性的細胞表面標志物，人們鑒定了在NSCs中表達的幾種蛋白，它們包括： Nestin， GFAP vimentin， Musashi， CD133等。 體外培養(yǎng)的干細胞球表達神經上皮細胞的特異性抗原Nestin，當神經細胞的遷移基本完成后Nestin的表達量開始下降，并隨神經細胞分化的完成而停止表達，已被廣泛應用于NSCs的鑒定。 GFAP vimentin的表達也比較早，起始于神經遷移完成時，分化完成后其表達下降。 Musashi可選擇性地在各種哺乳類動物的NSCs、祖細胞表達，并在維持干細胞狀態(tài)和分化中發(fā)揮重要的作用，因此Musashi 被作為哺乳類NSCs的標志蛋白。 CD133是一種細胞表面抗原，分選的CD133陽性的胚胎來源的腦細胞能增殖形成細胞球，而CD133陰性的細胞不能形成細胞球。 聯(lián)合應用CD133表面標志及免疫磁珠分選系統(tǒng)可有效地從人胎兒腦組織中直接分離得到高度的CD133陽性干細胞，細胞活力不受影響［7］。

　　3NSCs移植治療神經退行性疾病

　　有研究表明局灶性腦缺血可增強大鼠皮質和尾殼核的增殖能力，部分增殖細胞分化為神經元，參與神經網絡的重建但在損傷后完全依靠腦內少量的NSCs增殖分化尚不足以修復損傷的神經系統(tǒng)。 大量動物實驗證明神經替代和部分重建神經回路是可能的。 目前，在嚙吃類和靈長類動物模型已積累了移植NSCs治療帕金森病、缺血性中風、膠質瘤等中樞神經系統(tǒng)疾病的大量依據。

　　3.1帕金森病用于治療帕金森?。≒arkinson disease， PD）的多巴胺神經元來源有三條途徑：胚胎組織，NSCs體外培養(yǎng)產生多巴胺神經元和永生化祖細胞導入調節(jié)分化的基因而分化成多巴胺神經元，這三種途徑在動物實驗都獲得了成功。 向帕金森病模型大鼠紋狀體分別植入20萬，100萬和200萬人胚NSCs，發(fā)現(xiàn)移植細胞數目少者更易長出神經纖維且不易產生免疫排斥，但在體內只發(fā)現(xiàn)了少量TH陽性細胞［8］。 NSCs聯(lián)合膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子（GDNF）植入PD大鼠紋狀體內，能夠明顯提高PD大鼠紋狀體內多巴胺含量，對PD大鼠有一定的治療作用［9］。 Wagner等［10］的研究證實甲狀腺激素/維甲酸核受體超家族的轉錄因子Nurr 1為中腦多巴胺神經元的分化誘導所必需，把人胚多巴胺神經元移植到帕金森病患者腦內，能夠顯著改善60歲以下的臨床癥狀，但對60歲以上的癥狀未見明顯改善。

　　3.2亨廷頓病亨廷頓病是遺傳性的神經元變性疾病，以皮層和新紋狀體最為嚴重， NSCs植入大鼠亨廷頓病模型腦內能保護維持運動習慣的能力，受損的運動習性也可重新恢復，表明植入的細胞在體內形成了功能性連接［11］。

　　3.3缺血性中風Veizovic等［12］將小鼠NSCs移植入腦缺血大鼠模型腦內，NSCs不僅分布在移植一側的大腦半球，在損傷半球的皮層、紋狀體和胼胝體也有分布。 移植細胞能夠明顯改善感覺和運動功能缺陷，損傷的面積也明顯減少，但對空間學習記憶沒有顯著作用。 將胚胎海馬組織移植到全腦缺血受傷的海馬CA1區(qū)，可實現(xiàn)神經回路的重建。 將NSCs移植到中風模型大鼠腦內，一側完全偏癱的大鼠恢復了行走能力。 在血管源性腦缺血中，將血管內皮生長因子與NSCs聯(lián)合移植，有助于缺血損傷區(qū)域恢復，腦萎縮較輕［13］。 NSCs移植為恢復缺氧、缺血腦的功能提供了新的思路。

　　3.4阿爾茨海默病阿爾茨海默病（Alzheimer disease， AD）亦稱老年性癡呆，它是以進行性癡呆為特征的大腦退行性變性疾病，AD在發(fā)達國家已經成為僅次于心血管病、腫瘤和卒中而位居第4位的致死原因。 Qu等［14］將人NSCs體外擴增后移植到24 mo大鼠側腦室，4 wk后這些細胞非常有序地遷移到大腦廣泛部位，包括大腦皮層和海馬，并分化為神經細胞和星形膠質細胞，部分細胞長出樹突軸突并和宿主建立突觸聯(lián)系，用Morris水迷宮評價動物認知功能，發(fā)現(xiàn)由衰老引起的記憶損傷大鼠在NSCs移植后認知功能顯著改善，對正常成年鼠和記憶未損傷老年鼠的認知功能未有明顯影響。

　　3.5腦膠質瘤腦膠質瘤是臨床最常見的顱內腫瘤，藥物和放療效果欠佳，手術完全切除較困難且易復發(fā)。 NSCs作為外源基因的載體可應用于膠質瘤的基因治療，能夠彌補病毒載體的一些不足，其優(yōu)點是既可以穩(wěn)定表達外源的殺傷基因，對瘤細胞起到持續(xù)性殺傷作用，又可以和正常腦組織整合，修復由于腫瘤侵襲的腦組織。 Aboody等［15］研究發(fā)現(xiàn)，當NSCs植入膠質瘤鼠體內腫瘤后，它們會遍布整個腫瘤，并隨腫瘤向其他部位遷移；如果植入腦內遠離腫瘤的部位，NSCs也會穿過正常組織向腫瘤部位遷移。 目前對NSCs向腫瘤趨向性遷移的機制還不十分清楚，可能與腫瘤細胞釋放的某些因子或被腫瘤所破壞的腦組織釋放的某些因子有關。

　　總之，NSCs的體外培養(yǎng)成功為研究神經系統(tǒng)發(fā)育、分化及治療中樞神經系統(tǒng)疾病提供了新的思路。 隨著研究的深入，NSCs移植將有可能成為治療神經變性疾病和腦損傷的有效手段。 NSCs可以分離、培養(yǎng)并用細胞因子進行分化之后將其移植；也可將體內的NSCs激活、分化為神經元或膠質細胞。 最理想的策略是從需要治療的患者體內取出NSCs用于自身治療，有研究表明成年大鼠嗅粘膜NSCs可在普通培養(yǎng)基中形成干細胞克隆球，嗅粘膜中的其他細胞作為NSCs的基底飼養(yǎng)細胞有助于干細胞克隆球的形成，此方法簡便、安全，為嗅粘膜NSCs自體移植治療中樞神經系統(tǒng)損傷的可行性研究提供了動物實驗資料［16］。 目前對NSCs的研究已取得了很多成果，但仍存在許多急于解決的問題：如對NSCs的分化和功能修復機制還不甚清楚，移植后的細胞能否與體內細胞相結合，建立起正常的神經系統(tǒng)突觸聯(lián)系還需進一步研究。 移植到體內的NSCs與機體有無免疫排斥反應，是否能獲得成熟神經元的全部特性仍沒有搞清楚。 有報道表明睪丸支持細胞（Sertoli 細胞） 能夠分泌許多營養(yǎng)、調節(jié)、免疫抑制因子，它與胚胎神經細胞同移植可以提供營養(yǎng)并有抗免疫排斥的功能，不僅可以促進病情恢復還可以減少長期應用免疫抑制劑的危險［17］。 相信隨著研究的不斷深入，我們會取得更多的研究成果，NCSs一定能夠在臨床應用中發(fā)揮其重要的作用。

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